秦小妹 郭帥杰 李 悅 李思耐 劉衛(wèi)紅 王旭昀 劉紅旭 周明學(xué)▲

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)男科，北京 100010；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科，北京 100010

腦血栓是常見(jiàn)的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率等特點(diǎn)，且臨床預(yù)后差[1-2]。中醫(yī)治療腦血栓具有致殘率低、急性期患者生存質(zhì)量高、毒副作用小、治療花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。氣虛血瘀是腦血栓急性期的主要病機(jī)[5-6]，參元益氣活血膠囊（以下簡(jiǎn)稱“參元丹膠囊”）是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科劉紅旭主任研發(fā)的以益氣逐瘀為治法的院內(nèi)制劑，在臨床用于治療氣虛血瘀型不穩(wěn)定型心絞痛[7-8]。中醫(yī)腦心同治理論認(rèn)為，氣虛血瘀是腦血栓和冠心病共同的病因病機(jī)，但該藥用于治療腦血栓的研究目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)，斑馬魚(yú)模型因其可視性強(qiáng)、觀察方便、成本低和周期短等優(yōu)勢(shì)，在藥理藥效學(xué)研究中應(yīng)用逐漸增多[9-11]。因此，為了給參元丹膠囊新的臨床應(yīng)用適應(yīng)證提供實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)，本研究采用普納替尼誘導(dǎo)斑馬魚(yú)腦血栓評(píng)價(jià)參元丹膠囊治療腦血栓的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚(yú)，年齡為受精后2 d，共720 尾，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行養(yǎng)殖，飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚(yú)用水中（水質(zhì)：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm；pH 為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO3）[12]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC 認(rèn)證的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

參元丹膠囊（批號(hào)：Z20053327）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，按照臨床等效劑量換算，用蒸餾水配制成20 mg/ml 母液；普納替尼（批號(hào)：13771）購(gòu)于美國(guó)MCE 公司，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成20 mg/ml 的母液；阿司匹林（批號(hào)：J1910024）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用DMSO 配制成50 mg/ml 的母液。所有母液置于-20℃保存，按需稀釋。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

體式顯微鏡（SZX7，OLYMPUS）；六孔板（Nest Biotech）；96 孔板（NestBiotech）；精密電子天平[MS105DU/A，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，精密度0.01 mg]；行為分析儀（Zebra Lab 3.11，ViewPoint）；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon）；吖啶橙染料（批號(hào)：494-38-2，Sigma）；甲基纖維素（批號(hào)：079K0054V，Sigma）；DMSO（批號(hào)：BCBZ1685，Sigma）。

1.4 腦血栓斑馬魚(yú)模型的建立

采用1.5 μg/ml 普納替尼處理斑馬魚(yú)18 h，建立斑馬魚(yú)腦血栓模型[13]。在顯微鏡下觀察，拍照，統(tǒng)計(jì)形成腦血栓的斑馬魚(yú)數(shù)目，并采用行為分析儀測(cè)定斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)軌跡和速度，綜合評(píng)價(jià)腦血栓斑馬魚(yú)模型建立與否。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.5.1 藥物對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的改善功效評(píng)價(jià) 選取180 尾斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔30 尾，容量為3 ml，分為6 組，正常對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，參元丹膠囊高、中、低劑量組，分別予養(yǎng)魚(yú)用水，普納替尼（1.5 μg/ml），普納替尼（1.5 μg/ml）同時(shí)水溶給予阿司匹林（50 μg/ml）或參元丹膠囊（500.0、167.0、55.6 μg/ml）18 h 后，每組選取20 尾在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)形成腦血栓的斑馬魚(yú)數(shù)目，計(jì)算每組斑馬魚(yú)腦血栓的發(fā)生率。腦血栓發(fā)生率=斑馬魚(yú)腦血栓數(shù)目/斑馬魚(yú)數(shù)目[13]，記為I；腦血栓改善功效=I（模型組）-I（給藥組）/I（模型組）×100%[13]。參元丹膠囊濃度確定依據(jù)：根據(jù)本課題組前期濃度摸索預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參元丹膠囊改善腦血栓功效最大耐受濃度為500 μg/ml，所以最終將參元丹膠囊實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為55.6、167.0 和500.0 μg/ml。

1.5.2 藥物對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的行為學(xué)改善功效評(píng)價(jià)選取180 尾斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組及各組斑馬魚(yú)干預(yù)方法同“1.5.1”項(xiàng)下，每組選取20 尾斑馬魚(yú)應(yīng)用行為分析儀測(cè)定斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)速度（V）。藥物對(duì)腦血栓的運(yùn)動(dòng)速度改善功效計(jì)算公式如下：運(yùn)動(dòng)速度改善功效=V（給藥組）-V（模型組）/V（模型組）×100%[13]。

1.5.3 藥物對(duì)腦血栓的斑馬魚(yú)血流速度改善功效評(píng)價(jià)選取180 尾斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組和各組斑馬魚(yú)干預(yù)方法同“1.5.1”項(xiàng)下，每組選取20 尾斑馬魚(yú)置于心跳血流分析軟件下錄制斑馬魚(yú)血流視頻，分析斑馬魚(yú)血流速度（S）。藥物對(duì)腦血栓的血流速度改善功效計(jì)算公式如下：血流速度改善功效=S（給藥組）－S（模型組）/S（模型組）×100%[13]。

1.5.4 藥物對(duì)腦血栓的斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡抑制功效評(píng)價(jià) 選取180 尾斑馬魚(yú)置于六孔板中，每孔30 尾，分為6 組，具體分組和各組斑馬魚(yú)干預(yù)方法同“1.5.1”項(xiàng)下，用吖啶橙進(jìn)行染色，染色后每組選取20 尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下拍照，利用NIS-Elements D 3.10 高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡數(shù)（N）。藥物對(duì)腦血栓的腦部細(xì)胞凋亡抑制功效計(jì)算公式如下：腦部細(xì)胞凋亡抑制功效=N（模型組）-N（給藥組）/N（模型組）×100%[13]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett’s t-檢驗(yàn)；兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；多組率的兩兩比較采用Bonferroni方法校正。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的改善功效評(píng)價(jià)

與正常對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)腦血栓發(fā)生率明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚(yú)腦血栓發(fā)生率明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.017）。參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚(yú)腦血栓發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。參元丹膠囊高劑量組腦血栓改善功效為55%，參元丹膠囊中劑量組腦血栓改善功效為45%。見(jiàn)表1、圖1。

表1 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的改善功效評(píng)價(jià)（n=20）

圖1 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的影響（5.6×）

2.2 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的行為學(xué)改善功效評(píng)價(jià)

與正常對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)速度明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊低、中、高劑量組斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)速度明顯提高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低劑量組比較，參元丹膠囊中、高劑量組斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)速度明顯提高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊中劑量組運(yùn)動(dòng)速度改善功效為49%，參元丹膠囊高劑量組運(yùn)動(dòng)速度改善功效為47%。見(jiàn)表2、圖2。

表2 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的行為學(xué)改善功效評(píng)價(jià)（n=20）

圖2 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的行為學(xué)改善功效軌跡圖

2.3 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的血流速度改善功效評(píng)價(jià)

與正常對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)血流速度明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊中、高劑量組斑馬魚(yú)血流速度明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低、中劑量組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚(yú)血流速度升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊高劑量組血流速度改善功效為32%。見(jiàn)表3。

表3 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)的血流速度改善功效評(píng)價(jià)（n=20）

2.4 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡抑制功效評(píng)價(jià)

與正常對(duì)照組比較，模型組斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與模型組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡數(shù)明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與參元丹膠囊低、中劑量組比較，參元丹膠囊高劑量組斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。參元丹膠囊高劑量組斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡抑制功效為67%。見(jiàn)表4、圖3。

表4 參元丹膠囊對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡抑制功效評(píng)價(jià)（n=20）

圖3 參元丹膠囊處理后腦血栓斑馬魚(yú)腦細(xì)胞凋亡表型圖（140x）

3 討論

腦血栓是由于患者的腦部血液供應(yīng)障礙使腦組織局部出現(xiàn)不可逆的損傷，導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)缺血和缺氧，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損[14-16]。氣虛血瘀是腦血栓急性期的主要病機(jī)[17-18]，中醫(yī)腦心同治理論認(rèn)為，腦血栓和冠心病具有共同的中醫(yī)病機(jī)——?dú)馓撗鯷19-20]。參元丹膠囊由黃芪、水蛭、黨參、土元等中藥組成，臨床用于治療不穩(wěn)定型心絞痛，有效率可達(dá)90.3%[21]。方中黃芪和水蛭為君藥，配以黨參和土元，佐以地龍、丹參等共同起到益氣活血的功效。既往研究顯示，參元丹膠囊可明顯改善急性心肌梗死合并抑郁癥大鼠的行為異常，提高海馬神經(jīng)遞質(zhì)生成，促進(jìn)海馬神經(jīng)損傷修復(fù)[22]。因此，基于腦心同治理論和參元丹膠囊既往實(shí)驗(yàn)研究，推測(cè)參元丹膠囊有可能對(duì)腦血栓具有較好的治療作用。

傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物腦血栓模型成本高、死亡率高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，從而限制其在藥理學(xué)中的應(yīng)用。近年來(lái)，斑馬魚(yú)作為一種新的模式動(dòng)物，因其成本低、可體外受精、可視性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)周期短，而被廣泛用于評(píng)估藥物療效和安全性[23-25]。Zhu 等[13]報(bào)道，普納替尼處理后的斑馬魚(yú)，建立缺血性腦卒中模型，可出現(xiàn)斑馬魚(yú)腦血管內(nèi)皮損傷、腦血栓形成、血流量減少、運(yùn)動(dòng)能力下降，腦部細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)加重現(xiàn)象。與腦血栓患者的臨床特征和病理較為相似，并且具有可視性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)成功率高、周期短等優(yōu)勢(shì)，更適用于腦血栓治療藥物的快速療效評(píng)估和篩選實(shí)驗(yàn)。因此，本研究采用普納替尼誘導(dǎo)的腦血栓斑馬魚(yú)模型評(píng)價(jià)參元丹膠囊對(duì)該病的治療作用，為與實(shí)驗(yàn)體系保持一致，避免一些個(gè)體出現(xiàn)死亡，且有實(shí)驗(yàn)顯示選取20 尾斑馬魚(yú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)同30 尾結(jié)果無(wú)差異[26]，所以本研究將斑馬魚(yú)置于六孔板中，每組/每孔30 尾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組選取20 尾進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本研究結(jié)果顯示，普納替尼處理18 h 后的斑馬魚(yú)腦部出現(xiàn)明顯的血栓表型，并伴隨運(yùn)動(dòng)能力變差、運(yùn)動(dòng)速度降低、血流變慢和明顯的腦部細(xì)胞凋亡。提示腦血栓斑馬魚(yú)模型是一個(gè)重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便且造模死亡率低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，值得推廣應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，參元丹膠囊可明顯降低斑馬魚(yú)腦血栓的發(fā)生率，還可明顯促進(jìn)腦血栓斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)速度，改善其運(yùn)動(dòng)軌跡，此外，對(duì)腦血栓斑馬魚(yú)血流也有改善趨勢(shì)。在上述研究基礎(chǔ)上，本研究對(duì)其藥理機(jī)制進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)參元丹膠囊具有改善斑馬魚(yú)腦血栓的功效，可能與抑制斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，參元丹膠囊對(duì)普納替尼誘發(fā)的腦血栓斑馬魚(yú)具有一定的改善作用，并且隨著濃度增加，其改善作用更明顯，與抑制斑馬魚(yú)腦部細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究結(jié)果為拓展院內(nèi)制劑臨床應(yīng)用新的適應(yīng)證提供了實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)，但其具體的藥理機(jī)制和具體干預(yù)環(huán)節(jié)還需深入研究。