林玨龍，沈志忠，莊冰蓉，樸中賢，李偉秋，林麗吟

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是威脅人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，在我國(guó)食管癌屬高發(fā)疾病，每年新發(fā)病例約40萬(wàn)。潮汕地區(qū)是我國(guó)食管癌六大高發(fā)區(qū)之一，其死亡率一直居高不下[1]。研究食管癌治療新的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制不僅是開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物應(yīng)對(duì)腫瘤化療的有效手段，而且能夠開(kāi)發(fā)一些解決腫瘤化療耐藥性、糾正腫瘤藥物敏感性的藥物(如中醫(yī)藥制劑)以改善化療效果。國(guó)內(nèi)研究在利用中醫(yī)藥理論及臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，在天然中藥中發(fā)現(xiàn)多種具有抗癌作用和逆轉(zhuǎn)化療耐藥作用的活性物質(zhì)[2]。黃芪是一種常用的中藥材，是抗腫瘤治療的主要輔助中藥。黃芪的化學(xué)成分主要有多糖、皂苷類和黃酮類等，黃芪多糖可通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能而起輔助抗癌作用，能增強(qiáng)化療藥物的敏感性[3-4]。然而，黃芪多糖輔助抗癌的機(jī)制并不完全清楚。因此，本研究在食管癌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入黃芪多糖，構(gòu)建一個(gè)黃芪多糖作用于癌細(xì)胞的微環(huán)境，觀察和分析黃芪多糖對(duì)食管癌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低分化食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室提供；1640培養(yǎng)基、胰酶、青霉素鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；核糖核酸酶A、碘化丙碇、牛血清白蛋白、熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-FITC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；黃芪多糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。LSM 800激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) KYSE-150細(xì)胞接種于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中(培養(yǎng)皿內(nèi)鋪墊有多片蓋玻片，細(xì)胞在蓋玻片附著生長(zhǎng))，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，生長(zhǎng)密度為20%～30%時(shí)分為食管癌KYSE-150細(xì)胞組和KYSE-150細(xì)胞+黃芪多糖組，其中黃芪多糖終濃度50 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，生長(zhǎng)密度70%～80%。用0.15 mol/L，pH 7.2的PBS緩沖液洗去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗滌1～2次，4℃保存。

1.2.2 細(xì)胞染色 含KYSE-150細(xì)胞的載玻片經(jīng)PBS洗滌、吸凈，20 μL 0.2% Triton X 100處理10 min；PBS洗滌、吸凈，滴加15 μL Phalloidin-FITC(終濃度5～10 μg/mL)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)纖絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)、同步加入10 μL RNA酶(終濃度50 μg/mL)，室溫暗處?kù)o置2 h；PBS洗滌、吸凈，滴加10 μL碘化丙碇(10 μg/mL)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA，靜置20 min；PBS洗滌、吸凈。將各組含KYSE-150細(xì)胞的蓋玻片置于潔凈載玻片，制備可供激光掃描顯微鏡使用的標(biāo)本。

2 結(jié)果

利用Phalloidin-FITC特異標(biāo)記食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞的F-actin細(xì)胞骨架，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)KYSE-150細(xì)胞沿著細(xì)胞膜內(nèi)層形成粗大束狀的F-actin骨架纖維，呈現(xiàn)由F-actin骨架支撐的細(xì)胞延伸交錯(cuò)形成的侵襲性偽足，癌細(xì)胞間彼此侵入，重疊生長(zhǎng)；細(xì)胞間F-actin纖維支撐起的細(xì)胞膜狀似微絨毛的結(jié)構(gòu)短而少(圖1A)。食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞經(jīng)黃芪多糖誘導(dǎo)后，細(xì)胞膜內(nèi)層F-actin骨架纖維變纖細(xì)、豐富，大量的F-actin纖維支撐起細(xì)胞膜，促使細(xì)胞膜形成豐富的微絨毛狀結(jié)構(gòu)(圖1B)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞熒光染色 (Phalloidin-FITC，×400)

3 討論

黃芪的主要活性成分有黃芪多糖、皂苷類和黃酮類等。研究顯示黃芪多糖通過(guò)提高機(jī)體的免疫功能而起輔助抗癌作用，增強(qiáng)化療藥物的敏感性[3-4]；黃芪可增強(qiáng)癌癥患者T淋巴細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)免疫功能[5]；黃芪注射液可增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞的功能，產(chǎn)生抗肺癌作用[6]；黃芪可促進(jìn)食管癌患者癌間質(zhì)的肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集，改善患者的免疫功能[7]。

食管鱗狀細(xì)胞癌被診斷時(shí)通常已是晚期，患者的5年生存率較低，沒(méi)有有效的靶向治療藥物[8]。因此，尋找靶向治療或逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌的藥物并研究其作用機(jī)制至關(guān)重要。腫瘤的惡變是一系列多步驟和多階段的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞的抗藥性是造成患者死亡的主要原因[9]。食管鱗狀細(xì)胞癌的惡變是癌細(xì)胞侵入和遷移的過(guò)程，由肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組裝促使癌細(xì)胞形成偽足和棘突(異形)結(jié)構(gòu)而啟動(dòng)[10]。細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白有球狀肌動(dòng)蛋白(G-actin)和F-actin，細(xì)胞G-actin的聚合和F-actin的解聚無(wú)時(shí)無(wú)刻不在發(fā)生。侵襲性的癌細(xì)胞依賴于其肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化，影響F-actin應(yīng)力纖維的形成和細(xì)胞的伸長(zhǎng)[11]。許多癌細(xì)胞的侵襲性以F-actin為基礎(chǔ)，細(xì)胞膜突出形成侵襲性偽足或侵襲體，侵襲周圍的組織、血管和淋巴管[12-14]。通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架可以改變細(xì)胞遷移，并且在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞侵襲性方面有著潛在的作用[15-16]；干擾細(xì)胞組分F-actin的聚合，可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。

本研究利用Phalloidin-FITC特異標(biāo)記食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150的F-actin細(xì)胞骨架，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞沿著細(xì)胞膜內(nèi)層形成粗大束狀的F-actin骨架纖維，呈現(xiàn)由F-actin骨架支撐的細(xì)胞延伸交錯(cuò)形成的侵襲性偽足，癌細(xì)胞間彼此侵入，重疊生長(zhǎng)。粗大束狀的F-actin纖維減少了KYSE-150細(xì)胞表面的接觸，細(xì)胞間F-actin纖維支撐起的細(xì)胞膜狀微絨毛的結(jié)構(gòu)短而少，此結(jié)構(gòu)有利于KYSE-150細(xì)胞的浸入生長(zhǎng)，是惡性生長(zhǎng)癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架特征。而經(jīng)黃芪多糖誘導(dǎo)后，食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)層F-actin骨架纖維變得纖細(xì)、豐富，大量的F-actin纖維支撐起細(xì)胞膜，促使細(xì)胞膜形成豐富的微絨毛狀似結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞膜間的接觸面積；細(xì)胞膜纖細(xì)、豐富的微絨毛延伸使細(xì)胞間不易形成相互侵入的重疊生長(zhǎng)，構(gòu)成癌細(xì)胞良性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。腫瘤患者的最佳治療方案是非細(xì)胞毒性藥物治療，非細(xì)胞毒性藥物治療可誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的良性轉(zhuǎn)化，通常伴有肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞間黏附的提升、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的抑制和非錨定生長(zhǎng)的喪失[18]。由此推測(cè)黃芪多糖誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞F-actin骨架的重構(gòu)，此變化有利于細(xì)胞間的信息交流，其結(jié)果可能促使癌細(xì)胞的良性轉(zhuǎn)化。綜上所述，黃芪多糖可能具有誘導(dǎo)低分化的食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE-150細(xì)胞良性轉(zhuǎn)化的作用，可為中醫(yī)藥抗腫瘤的輔助治療提供依據(jù)。