賴敏超，朱夢婷，周丹雅，張曉娟，張 也，劉清嫻，王 典

(1．汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，廣東 汕頭 515041；3．汕頭大學醫(yī)學院護理系，廣東 汕頭 515041)

腦血管疾病占我國居民死因的第3位，其中缺血性腦卒中病例占全部腦血管疾病的80%以上[1]。急性進展性缺血性腦卒中(acute progressive ischemic stroke，APIS)是缺血性腦卒中的重要類型，該病征的癥狀進展快，治療效果差[2]。目前，導致APIS的病理生理機制仍未完全清楚，需從不同層面探尋相關(guān)病理生理特征[3]。血清代謝組學可反映患者整體代謝與機能狀態(tài)，有望為了解進展性腦卒中的病理生理過程和精準治療提供參考。本研究探討APIS與急性非進展性缺血性腦卒中(acute non-progressive ischemic stroke，ANPIS)患者血清代謝組的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取15例APIS患者和25例ANPIS患者為研究對象。急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)的診斷標準參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[4]：(1)急性起??；(2)局灶神經(jīng)功能缺損(一側(cè)面部或肢體無力或麻木，語言障礙等)，少數(shù)為全面神經(jīng)功能缺損；(3)影像學出現(xiàn)責任病灶或癥狀/體征持續(xù)24 h以上；(4)排除非血管性病因；(5)腦CT/MRI排除腦出血。APIS的診斷參考文獻[3]：入院后至第5天期間，美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)評分增加2分或以上(或出現(xiàn)卒中相關(guān)死亡)。其他急性缺血性腦卒中病例歸為ANPIS。排除標準為有以下情況之一：嚴重的肝腎功能不全、嚴重感染、惡性腫瘤以及無法進行頭部影像學檢查(CT/MRI檢查)。本研究經(jīng)汕頭大學醫(yī)學院倫理委員會批準，入選患者均簽署知情同意書。

收集研究對象的性別、年齡、高血壓及糖尿病病史、NIHSS評分、改良Rankin量表(modified Rankin scale，mRS)評分、生化指標等臨床資料。采集研究對象空腹外周血3 mL，4℃、3 000 r/min離心5 min，分離血清，將血清凍存于-80℃待測。

1.2 代謝組分析

1.2.1 血清標本預處理 血清解凍、振蕩后，取50 μL 于 EP 管中，加 800 μL 甲醇和 50 μL 超純水，旋渦振蕩1 min；4℃，10 000 r/min離心10 min；取200 μL上清至GC管，并加入 20 μL 0.5 mmol/L正亮氨酸內(nèi)標；70℃，用氮吹儀吹干約15 min；加入20 μL二氯甲烷，繼續(xù)吹干約3 min；往GC管加入30 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/mL)，室溫放置16 h，加入30 μL N-甲基三甲硅基三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷作為催化劑)，室溫放置1 h后上機檢測。

1.2.2 GC-MS檢測條件 使用美國Agilent 7890/5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和Agilent DB-5MS色譜柱(30 m×250 μm ×0.25 μm)。色譜條件：不分流進樣，柱溫采用程序升溫，溶劑延時10 min，初始溫度60℃，保持2 min，以5℃/min升至285℃，保持10 min，載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；進樣量1 μL，進樣口溫度 230℃，接口溫度290℃。質(zhì)譜條件：采用EI源，電子轟擊電壓70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；掃描方式為全掃描，掃描范圍為35～800 u。

1.2.3 代謝輪廓分析 將所檢測到的代謝指紋圖譜導入Agilent自帶的ChemStation軟件，轉(zhuǎn)換成CDF格式，運用R 2.7.2語言軟件進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)提取，生成數(shù)據(jù)矩陣，導入SIMCA 13.0.3進行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)建模，分析患者血清的代謝輪廓。根據(jù)荷載圖分布情況以及R2Y與Q2判斷組間總體代謝輪廓的差異(R2Y反映模型的穩(wěn)定性，Q2反映模型的預測性，兩者越接近1，說明模型的穩(wěn)定性和預測性越好)。

1.2.4 代謝物的定性及差異分析 GC-MS代謝譜導入Chem Station軟件，參考美國國家標準與技術(shù)研究院譜庫來定性代謝物。主要參考匹配度(Match)、可能性(Probability)及保留指數(shù)(Retention index)等指標來鑒定各種代謝物。應用Chem Station軟件生成色譜圖的離子峰的峰面積，進行相對定量。差異代謝物采用人類代謝組學數(shù)據(jù)庫(HMDB，http://www.hmdb.ca/)、京都基因與基因組百科全書(KEGG，http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)篩選相關(guān)的代謝通路。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(Q1,Q3)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

APIS組患者的出院NIHSS評分、mRS評分明顯高于ANPIS組(均P＜0.05)，提示前者預后更差，與該類患者的臨床特征相符。此外，APIS患者中，谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐等反映肝腎功能的指標高于ANPIS組(均P＜0.05)。兩組患者在性別、年齡以及高血壓、糖尿病、房顫患病率、血脂、血糖值、凝血相關(guān)指標等方面的差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 患者的基本臨床信息及生化指標

2.2 代謝輪廓的差異

基于GC-MS數(shù)據(jù)的PLS-DA的荷載圖顯示兩組明顯分開，其PLS-DA荷載圖區(qū)分良好，R2Y=0.568，Q2=0.534，提示APIS患者與ANPIS患者的血清代謝組差異顯著，見圖1。

圖1 PLS-DA荷載圖

2.3 差異代謝物及相關(guān)代謝通路

患者血清中鑒定出31種代謝物，其中兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)的8種(表2)，包括在APIS患者中上調(diào)的蘇氨酸、順式棕櫚酸、棕櫚酸、反油酸、絲氨酸，以及下調(diào)的脯氨酸、次黃嘌呤、谷氨酰胺。這些代謝物所反映的代謝通路主要包括精氨酸與脯氨酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成代謝、甘氨酸與絲氨酸代謝、嘌呤代謝、甘油酯代謝與脂肪酸代謝以及嘌呤代謝與鳥氨酸循環(huán)等(表2)。其中的6種差異代謝物與腦卒中的風險因子存在一定的相關(guān)性，特別是脂肪酸(順式棕櫚酸、棕櫚酸)與NIHSS評分存在正相關(guān)(表3)，提示其很可能參與APIS癥狀的惡化過程。

表2 APIS患者與ANPIS患者血清差異代謝物

表3 差異代謝物與腦卒中的危險因子及血生化指標的相關(guān)性

3 討論

APIS因病情進展快，預后差，是神經(jīng)內(nèi)科中面臨的重難點問題[2-3]。因此，進一步了解APIS的病理生理過程具有重要意義。血清代表個體的整體代謝水平，能更直接地反映患者的整體機能狀態(tài)。血清代謝組學已被用于探討腦卒中發(fā)生的病理生理機制，并篩選相關(guān)的診斷與鑒別診斷標記物[5-6]。目前應用代謝組學方法發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中的代謝障礙主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、葉酸循環(huán)代謝和脂類代謝等。目前未見APIS代謝組學研究的報道。本研究通過比較APIS與ANPIS患者之間血清代謝組的差異，有望找到APIS相關(guān)的代謝特征，為診治提供新的線索。

本研究發(fā)現(xiàn)，APIS患者與ANPIS患者血清代謝輪廓差異顯著，提示代謝很可能是參與APIS病情進展與惡化的關(guān)鍵因素。本研究在血清中共篩選到了8種差異代謝物，其中上調(diào)的5種，包括2種氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸)與3種脂肪酸(順式棕櫚酸、棕櫚酸、反油酸)，提示了其相關(guān)的甘氨酸與絲氨酸代謝、甘油酯代謝、脂肪酸代謝、磷脂酰乙醇胺合成代謝等通路參與APIS。絲氨酸與脂肪酸的升高，反映了細胞膜磷脂分解的增強，提示在APIS的狀態(tài)下，細胞與細胞膜系統(tǒng)的破壞更明顯，梗死細胞的壞死更嚴重[7]。下調(diào)的代謝物有3種，包括2種氨基酸(脯氨酸、谷氨酰胺)與1種核苷酸前體(次黃嘌呤)；反映了在APIS狀態(tài)下脯氨酸代謝、嘌呤代謝與鳥氨酸循環(huán)、精氨酸與脯氨酸代謝可能被明顯抑制。谷氨酰胺在腦中固定轉(zhuǎn)運氨中發(fā)揮重要作用，其含量下降，提示APIS狀態(tài)下，更多的谷氨酰胺被用于氨的轉(zhuǎn)運，也提示APIS具有更顯著的神經(jīng)毒性癥狀。次黃嘌呤在代謝過程可產(chǎn)生氧化應激，其含量的下降表明更多的次黃嘌呤代謝導致活性氧的增加[8]。該結(jié)果提示APIS狀態(tài)下具有更高的氧化應激水平，這與已報道的APIS發(fā)生機制相符[2-3]。

綜上所述，APIS患者與ANPIS患者的血清代謝組存在差異，提示APIS與嚴重的膜磷脂的破壞、神經(jīng)細胞壞死、神經(jīng)毒性、氧化應激有關(guān)。