張歡潤， 岳廣欣， 梁 媛， 楊婧雯， 李 妍， 吳望男， 聶文祎， 楚天云， 鞏子漢， 佘楷杰

(中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所， 北京 100700)

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，其高復發(fā)率、高自殺率對個人及社會造成了較大危害[1]。近年來，抑郁癥的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，有學者預計，由該病所產(chǎn)生的相關支出將在2030年成為全球范圍內(nèi)所有疾病負擔之首[2]。抑郁癥的發(fā)病機制有很多假說，單胺神經(jīng)遞質(zhì)學說受到廣泛認可。多巴胺(dopamine，DA)是獎賞功能最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與人的精神情緒活動密切相關，多項研究表明，抑郁癥的發(fā)病與DA的含量下降有關[3]。

目前臨床上有很多治療抑郁癥的藥物，如三環(huán)及四環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑和選擇性 5-羥色胺再攝取抑制劑等，但僅對 1/3 的患者顯現(xiàn)出明顯改善作用，且藥物起效存在數(shù)周至數(shù)月的潛伏期[4]。中醫(yī)藥抗抑郁具有多靶點、療效好、不良反應少等獨特優(yōu)勢。大量臨床與實驗文獻證實，肝郁脾虛證是抑郁癥最常見的證型，逍遙散是中醫(yī)治療肝郁脾虛證的經(jīng)典方劑，對抑郁癥有著明確的治療效果[5，6]。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，慢性輕度應激大鼠出現(xiàn)糖水攝入量減少、食欲與性欲下降等獎賞功能紊亂的癥狀表現(xiàn)，且伴有中樞和外周多巴胺(dopamine，DA)含量變化，逍遙散對此具有明顯的調(diào)節(jié)作用[7,8]。在前期研究基礎上，提出解郁名方逍遙散除了能夠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡、神經(jīng)突觸可塑性以及腦腸軸等多方面機制發(fā)揮抗抑郁效應[5]之外，是否還能對獎賞功能產(chǎn)生影響這一科學性問題。因此，本研究從獎賞腦區(qū)DA及其受體與轉(zhuǎn)運體的基因與蛋白表達水平等方面，觀察逍遙散對應激抑郁大鼠的干預作用，進一步探究逍遙散治療抑郁癥的作用機制。本研究已通過中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所實驗動物倫理委員會批準，批準號2019-003。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所SPF級動物房，許可證號SYXK(京)2021-0017。室溫22±2 ℃，濕度34%～44%，明暗周期12 h，適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 中藥及其制備

逍遙散組成：柴胡15 g，當歸15 g，白芍15 g，白術15 g，茯苓15 g，生姜5 g，薄荷5 g，炙甘草7.5 g，組方選自《太平惠民和劑局方》。中藥飲片購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司，生產(chǎn)許可證號(皖)Y20170043，生產(chǎn)批號800000397。以上中藥分別加10倍、8倍、8倍水煎煮3次，過濾沉渣、濃縮、低溫真空干燥為浸膏，粉碎、低溫干燥備用。使用前稀釋為含生藥7.41 g/mL的中藥混懸液[9]。

1.3 主要試劑與儀器

DA、3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacelic acid，DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)標準品，96%(Extrasynthese，北京索萊寶生物科技有限公司)；色譜柱為 XB-C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Welch公司)；Trizol試劑(貨號15596-026，美國Invitrogen公司)；所有引物均由寶生物(大連)工程有限公司合成；SYBR Green PCR熒光定量試劑盒(貨號4368708，美國Applied Biosystems公司)；多巴胺受體1(Dopamine receptor 1，D1R,abcam,貨號ab20066),多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter，DAT,abcam,貨號ab18445), 多巴胺受體2(dopamine receptor 2，D2R,Proteintech,貨號55084-1-AP)，以上一抗均購自北京永泰興成商貿(mào)有限公司。

3K15sICbIA高速泠凍離心機(上海珂淮儀器有限公司)；Nexera UHPLC LC-30A高效液相色譜儀(Shimadzu)，Mass Spectrometer QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜儀(AB Sciex)。

1.4 分組與造模

根據(jù)課題組前期實驗方法進行應激易感大鼠的篩選，即施加2周應激因素后按糖水測試結(jié)果將應激大鼠分為應激易感大鼠(糖水消耗下降40%以上)與應激恢復大鼠(糖水消耗未減少)，取應激易感大鼠納入下一步實驗，隨機分為模型組和逍遙散組[8]，另設正常對照組5只/籠群養(yǎng)共10只。模型組與逍遙散組大鼠繼續(xù)施加4周的應激因素，連續(xù)造模時間共計6周[8]。應激與灌胃給藥過程中陸續(xù)有大鼠損耗，最后模型組10只，逍遙散組14只大鼠納入行為學實驗。

1.5 給藥方法

逍遙散組大鼠從第3周開始灌胃逍遙散混懸液，連續(xù)給藥4周。每天開始應激前30 min給藥，根據(jù)前期實驗制定最佳給藥劑量為2.224 g·kg-1·d-1，以生藥量計算為中劑量[10]。模型組和正常組大鼠灌胃相同體積純水。造模加灌胃4周后進行行為學檢測。

1.6 行為學檢測

1.6.1 曠場實驗 大鼠適應行為學室15 min后，放入曠場箱(120 mm×120 mm×45 cm)中心點，設中心點附近60 mm×60 cm區(qū)域為中央?yún)^(qū)，其余區(qū)域為周圍區(qū)。記錄各組大鼠5 min運動總距離(mm)、中央?yún)^(qū)進入次數(shù)(次)、中央?yún)^(qū)停留時間(s)、中央?yún)^(qū)運動距離(mm)、周圍區(qū)停留時間(s)和周圍區(qū)運動距離(mm)。

1.6.2 O迷宮 O迷宮是改良的高架十字迷宮，外徑95 cm、內(nèi)徑85 cm，分為開臂和閉臂，閉臂高20 cm，O迷宮離地面高60 cm。實驗時將大鼠放入開臂上，頭向閉臂，觀察5 min內(nèi)大鼠的開放臂停留時間(s)、開放臂運動距離(mm)、封閉臂停留時間(s)、封閉臂運動距離(mm)、5 min平均速度(mm/s)和5 min運動總距離(mm)。

1.7 液質(zhì)聯(lián)用(high performance liquid chromato-graphy-mass Sp，HPLC-MS)方法檢測前額皮質(zhì)與伏核DA、DOPAC、HVA濃度

行為學實驗完成后每組各取5只大鼠麻醉處死，冰上剝腦，用飛鷹牌保安刀片切出各層腦片，手術刀剝離出前額皮質(zhì)與伏核。取前額皮質(zhì)與伏核樣本50 mg～60 mg，加入0.1%甲酸-水混合物勻漿，離心、復溶后取上清液進樣。色譜條件：水相為0.1%甲酸水溶液(DA&DOPAC)/純(HVA)，有機相為乙腈，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5.00 μL。用 Analyst(AB Sciex)軟件采集目標物的色譜圖并計算積分，以 1/X2為加權系數(shù)進行線性回歸。

1.8 熒光定量PCR檢測前額皮質(zhì)與伏核D1R、D2R、DAT(SLC6A3 )mRNA表達

每組各取5只大鼠，Trizol法提取各組大鼠左側(cè)腦前額皮質(zhì)與伏核的總RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度，將濃度過高的RNA進行適當比例稀釋，使其終濃度為100～500 ng/μL。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，存入-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用SYBR Green PCR熒光定量試劑盒檢測D1R、D2R、DAT(SLC6A3)轉(zhuǎn)錄表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。所有引物均由寶生物(大連)工程有限公司合成，2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

表1 引物序列表

1.9 Western blot檢測前額皮質(zhì)與伏核腦區(qū)D1R、D2R、DAT蛋白表達

收集各組大鼠右側(cè)前額皮質(zhì)與伏核到EP管中，提取組織總蛋白并對濃度進行測定。各組統(tǒng)一取蛋白樣品20 μg進行 12.5% SDS-PAGE電泳，蛋白分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶37℃、封閉2 h、PBST洗膜后加入相應的一抗(D1R 1∶1000，D2R 1∶1000，DAT 1∶1000)4 ℃孵育過夜。內(nèi)參為β-actin(1∶3000)，PBST洗膜5×15 min，依次加入山羊抗兔的二抗(1∶3000)37 ℃ 孵育 1 h后，TBST 洗膜 5×15 min，在膜上滴加ECL顯色液后進行曝光、顯影和定影，采用PhotoShop和Alpha整理去色、分析目標光密度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場實驗結(jié)果

表2示，慢性輕度不可預見應激模型大鼠5 min曠場實驗中央?yún)^(qū)進入次數(shù)與停留時間、中央?yún)^(qū)運動距離均有極其顯著減少(P<0.01)，5 min運動總距離明顯下降(P<0.05)，表明逍遙散能顯著上調(diào)中央?yún)^(qū)進入次數(shù)(P<0.05)。

表2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較

2.2 各組大鼠O迷宮實驗結(jié)果

表3示，慢性輕度不可預見應激模型大鼠5 min平均速度、開放臂停留時間、開放臂運動距離、封閉臂運動距離、5 min運動總距離均有顯著下降(P<0.05，P<0.01)，封閉臂停留時間明顯上升(P<0.05)，除封閉臂運動距離外，逍遙散對其余指標均有顯著上調(diào)作用(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組大鼠O迷宮實驗結(jié)果比較

2.3 各組大鼠前額皮質(zhì)與伏核DA、DOPAC、HVA含量比較

圖1、2示，與正常組比較，模型組前額皮質(zhì)與伏核中DA與DOPAC含量、伏核中HVA含量均明顯低于正常組(P<0.05，P<0.01)，表明逍遙散能顯著上調(diào)模型組各腦區(qū)DA和HVA水平(P<0.05，P<0.01)。逍遙散組前額皮質(zhì)中DOPAC含量也有顯著上升(P<0.01)，伏核腦區(qū)中DOPAC水平雖有上調(diào)趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01

2.4 各組大鼠前額皮質(zhì)D1R、D2R、DAT的蛋白與mRNA表達

圖3示，前額皮質(zhì)與正常組比較，模型組D1R的蛋白與mRNA表達均顯著上升(P<0.01)，DAT的蛋白表達明顯增加(P<0.05)，逍遙散對上述指標均有顯著下調(diào)作用(P<0.05，P<0.01)。模型組D2R的蛋白與mRNA表達較正常組均有明顯下降(P<0.05)，逍遙散對其均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)作用(P<0.05，P<0.01)。

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05, △△P<0.01

2.5 各組大鼠伏核D1R、D2R、DAT的蛋白與mRNA表達

圖4示，伏核與正常組比較，模型組D1R蛋白與mRNA表達均顯著上升(P<0.01)，DAT的蛋白與SLC6A3 mRNA表達也顯著上升(P<0.05)，逍遙散對上述指標均有顯著下調(diào)作用(P<0.05，P<0.01)。模型組D2R的蛋白與mRNA表達較正常組均有明顯下降(P<0.05)，逍遙散能夠顯著上調(diào)D2R蛋白表達(P<0.05)。

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

慢性不可預見應激模型在動物實驗中應用廣泛，可模擬人類抑郁癥發(fā)病機制[11]。曠場實驗、高架O迷宮是評價嚙齒類動物抑郁焦慮情緒的經(jīng)典方法[12]。行為學結(jié)果顯示，慢性輕度不可預見應激模型大鼠在曠場實驗中活動性明顯降低，在中央?yún)^(qū)域的進入次數(shù)與停留時間也較正常對照組顯著下降。在O迷宮開放臂停留時間、進入次數(shù)及運動距離均有明顯降低，在封閉臂的停留時間明顯延長。分析結(jié)果可知，造模使大鼠對陌生環(huán)境的探索與適應能力下降、主動性與積極性降低，焦慮情緒增長，表現(xiàn)出明顯的抑郁樣癥狀。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起極其重要的作用[13]。DA是獎賞系統(tǒng)中主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，DOPAC和HVA是DA的主要代謝產(chǎn)物，能夠反映中樞DA神經(jīng)元的功能狀態(tài)[13]。本研究中，模型組大鼠在接受慢性應激刺激后，前額皮質(zhì)、伏核腦區(qū)DA、DOPAC、HVA的含量均較正常組明顯下降。與國外1項研究發(fā)現(xiàn)，慢性應激能夠減少內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)中DA含量，與提高嚙齒類動物在社會擊敗中的易感性結(jié)果一致[14]，說明慢性應激可能是通過下調(diào)腦內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物水平，進而影響獎賞系統(tǒng)功能、導致快感減低等抑郁相關的癥狀表現(xiàn)。

神經(jīng)受體假說認為，抑郁癥的發(fā)病與DA受體異常表達相關[15]。DA受體可分為D1樣和D2樣受體兩類。D1R屬于興奮型D1樣受體，主要定位于突觸后膜，激活后能夠誘發(fā)多個細胞內(nèi)信號通路，增強神經(jīng)元的興奮性，參與個體快感體驗能力的維持[16]。實驗證實，給小鼠注射D1R受體拮抗劑可以減少其運動動機[17]。D2R屬于D2樣受體，分布于DA能神經(jīng)元突觸前膜，其所介導的信號通路作用與D1R正好相反，D2R和DA結(jié)合后可以通過激活G蛋白門控內(nèi)向整流鉀離子通道，反過來使DA能神經(jīng)元發(fā)生超極化，降低DA神經(jīng)元興奮性，抑制DA的釋放[18]。伏核參與獎勵相關過程，激活伏核中阿片類受體和內(nèi)源性大麻素受體，增強機體對食物獎勵的情感反應。但在快感缺失人群中，這種獎勵進程會被中斷[19]。前額皮質(zhì)是除海馬以外最容易受到應激影響的腦區(qū)之一，慢性應激導致的前額皮質(zhì)神經(jīng)形態(tài)、突觸密度與功能的改變與多種情緒與認知功能失調(diào)有關[20]。本研究結(jié)果顯示，慢性輕度不可預見應激抑郁大鼠前額皮質(zhì)和伏核腦區(qū)D1R mRNA與蛋白表達較正常組有所上升，D2R mRNA與蛋白表達下降。與抑郁癥自殺者尸檢發(fā)現(xiàn)，腦紋狀體組織中D1R含量增加結(jié)果一致[21]，說明DR1和D2R均參與慢性輕度不可預見應激抑郁的發(fā)生過程，其相反的表達趨勢可能與二者在抑郁發(fā)病過程中所發(fā)揮的作用并不相同有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠腦組織中DAT的基因與蛋白表達上升。DAT位于神經(jīng)細胞突觸前膜，可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)DA存儲池的存儲數(shù)量，在維持多巴胺能神經(jīng)傳遞的穩(wěn)態(tài)方面有十分重要的作用。DAT受體增加會引發(fā)突觸間隙DA的耗竭，突觸后D1和D2受體表達代償性改變[25]。對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，DAT基因敲除小鼠細胞外DA濃度增加了5倍，而DAT基因加載小鼠紋狀體細胞外DA水平持續(xù)性降低，并顯示出突觸后D1R水平有顯著升高[26]。故推測本實驗中DAT和DA受體的變化都反映了應激后DA能系統(tǒng)處于非穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，進而導致個體對長期慢性應激表現(xiàn)出超敏反應，影響到動物的行為與情緒。

內(nèi)科名方逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、白術、茯苓、當歸、甘草、生姜、薄荷8味藥物組成，能疏肝解郁、養(yǎng)血健脾，是臨床常用調(diào)和肝脾的代表方，對抑郁癥有明確的治療作用[24-26]，其抗抑郁的作用可由多種機制介導。本實驗中，逍遙散能顯著上調(diào)曠場中央?yún)^(qū)進入次數(shù)，上調(diào)O迷宮實驗中5 min平均速度、開放臂停留時間、開放臂運動距離、5 min運動總距離，減少封閉臂停留時間，使抑郁狀態(tài)改善。同時，逍遙散對模型大鼠各腦區(qū)的DA、DOPAC和HVA水平有不同程度上調(diào)作用，還能顯著降低模型大鼠前額皮質(zhì)與伏核腦區(qū)中D1R mRNA及蛋白表達，升高前額皮質(zhì)D2R mRNA及蛋白表達水平，對伏核腦區(qū)中DAT mRNA及蛋白表達也有下調(diào)作用。根據(jù)行為學及指標進行推測，逍遙散對慢性輕度不可預見應激抑郁大鼠的治療作用，可能與其調(diào)節(jié)模型大鼠前額皮質(zhì)與伏核腦區(qū)DA及其代謝產(chǎn)物水平，DA受體D1R、D2R及DAT的表達，反饋性地調(diào)節(jié)DA受體平衡與穩(wěn)定狀態(tài)相關，其干預機制可能包括逍遙散能夠通過阻斷突觸后DA受體，使DA能神經(jīng)元反饋性興奮，釋放更多的DA神經(jīng)遞質(zhì)；逍遙散通過抑制突觸前膜DAT，降低對突觸間隙DA的重攝取與轉(zhuǎn)運，從而減少對DA的清除，使突觸間隙DA含量增加或DA消減時間延長，從而增強DA神經(jīng)元介導的獎賞效應。