魏茂林 楊珍 董曉英 馮遜遜

早發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)功能紊亂疾病，是介于卵巢儲(chǔ)備功能下降和卵巢早衰之間的一種卵巢低反應(yīng)狀態(tài)，主要表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵泡池減少和卵泡功能障礙[1]。POI的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響了女性的生殖健康。

研究表明，POI的發(fā)生與卵巢微環(huán)境密切相關(guān)[2]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)蛋白可以抑制卵巢氧化應(yīng)激的發(fā)生，改善卵巢微環(huán)境，對卵泡發(fā)育有一定的積極作用[3]。Akt通過多種機(jī)制被激活，活化磷酸化Akt通過抑制結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex，TSC)復(fù)合物TSC1和TSC2，直接或者間接地激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammlian target of rapamycin,mTOR)通路[4]。前期研究表明，毓麟珠可以通過激活mTOR信號通路，調(diào)整通路中S6K和4E-BPl等相關(guān)蛋白的表達(dá)，對免疫性POI模型小鼠卵泡發(fā)育有積極影響[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究觀察中藥毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織氧化應(yīng)激狀態(tài)、卵巢組織病理形態(tài)以及TSC1、TSC2、Akt和mTOR下游相關(guān)蛋白等表達(dá)的影響，探討其治療免疫性POI的機(jī)制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選定84只6～8周齡動(dòng)情周期正常的SPF級BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g。該批動(dòng)物由北京維通利華公司提供，批號為SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，批號：AEEI-2015-028。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 造模試劑 用高精度電子秤稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉末[根據(jù)小鼠透明帶3(ZP3)330-342個(gè)氨基酸序列(NAAAAQFQIHGPR)合成，加入6 mL蒸餾水，溶解混勻，制成透明帶多肽溶液]，其中一半與等量的弗氏完全佐劑混勻作為免疫制劑，另一半與等量的弗氏不完全佐劑混勻作為免疫增強(qiáng)劑。透明帶多肽粉末購自杭州中肽生化有限公司(批號：CR-10-0068Z)，弗氏完全佐劑(批號：F5881)、弗氏不完全佐劑(批號：F5506)購自美國Sigma公司。

1.2.2 中藥 毓麟珠藥物組成：當(dāng)歸、熟地黃、菟絲子各12 g，人參、麩炒白術(shù)、茯苓、白芍、杜仲、鹿角霜、川椒各6 g，川芎、炙甘草各3 g。中藥飲片均由北京同仁堂有限公司提供。劑型為水煎劑，小鼠給藥劑量根據(jù)“人與動(dòng)物體表面積比例”配置高、中、低劑量藥液[6]，分別為每mL含生藥量0.234 g、0.468 g、0.936 g。藥物煎出后，4℃保存。

1.2.3 陽性對照藥 戊酸雌二醇片(德國拜耳公司，批號：219A2)。小鼠給藥劑量參照“人與動(dòng)物體表面積比例”[6]使用去離子水配置藥液，給藥量為9 mg/mL。

1.2.4 主要試劑 蘇木素染液(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號：517-28-2)；伊紅染液(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號：17372-87-1)；二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：1330-20-7)；EDTA抗原修復(fù)液(北京中科萬邦生物科技有限公司)；牛血清白蛋白V(Solarbio，批號：A8020)；DAB顯色劑(北京中科萬邦生物科技有限公司)；羊抗兔IgG(H+L)，HRP(Jackson，批號：111-035-003)；羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(Jackson，批號：115-035-003)；BCA蛋白定量試劑盒(Cwbiotech，批號：02912E)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，批號：RR036A)；熒光定量PCR試劑(Roche，批號：04887352001)。

1.3 造模、給藥及取材

1.3.1 動(dòng)物造模 通過陰道涂片挑選出動(dòng)情周期正常的雌性小鼠84只，隨機(jī)選擇其中14只作為空白組，其余70只用于建立POI模型。造模小鼠于腹部皮下多點(diǎn)注射ZP3多肽免疫制劑(0.15 mL)，兩周后皮下多點(diǎn)注射ZP3多肽免疫增強(qiáng)劑(0.15 mL)[7]；空白組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)皮下注射等量生理鹽水。

1.3.2 分組給藥 造模結(jié)束后，通過陰道涂片觀察，動(dòng)情周期紊亂則造模成功。將造模成功的70只小鼠隨機(jī)分為模型組，陽性藥組，毓麟珠高、中、低劑量組，每組14只。除空白組和模型組給予生理鹽水灌胃外，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃。每只小鼠灌胃0.5 mL，每周給藥6天，每天1次，連續(xù)給藥6周。

1.3.3 取材 干預(yù)結(jié)束后第二天進(jìn)行標(biāo)本取材。心臟穿刺取血；取兩側(cè)卵巢以及子宮并稱重，其中一側(cè)卵巢放入液氮中，-80℃保存；另一側(cè)放入4%多聚甲醛中固定，待用。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 小鼠卵巢組織形態(tài) 取出在多聚甲醛中固定的小鼠卵巢，進(jìn)行脫水、透明處理、浸蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、封片，顯微鏡下觀察。

1.4.2 小鼠卵巢組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定 每組隨機(jī)挑選出6個(gè)在-80℃冰箱中保存的小鼠卵巢組織，梯度復(fù)溫切碎，加入蛋白裂解液后研磨，13 000 r/分鐘，4℃，離心20分鐘后取上清，蛋白質(zhì)定量法測定總蛋白濃度，在酶標(biāo)儀測定吸光度值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)描述的蛋白濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各指標(biāo)的值。

1.4.3 小鼠卵巢組織中TSC1、TSC2、Akt蛋白表達(dá) 以免疫組化法檢測。每組隨機(jī)取出6個(gè)固定在多聚甲醛中的卵巢，用不同濃度的酒精梯度脫水，EDTA修復(fù)液修復(fù)，3%雙氧水以及牛血清白蛋白常溫孵育，一抗二抗處理后，加入顯色劑顯色，復(fù)染，梯度酒精脫水，透明處理，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 小鼠卵巢組織中RheB、P-4E-BP1、P-sbk1相關(guān)蛋白表達(dá) 以蛋白免疫印記法檢測。每組隨機(jī)取出6個(gè)保存在-80℃的卵巢，梯度復(fù)溫切碎，加入裂解液，勻漿取上清，利用蛋白質(zhì)定量法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白分子量制膠，加入樣品以及Marker，進(jìn)行電泳。依次轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗、二抗孵育、洗膜，加入發(fā)光液、曝光、顯影、定影，最后觀察條帶狀況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 毓麟珠對免疫性POI小鼠陰道分泌物的影響

空白組小鼠陰道涂片顯示每隔4～5天小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的動(dòng)情周期，動(dòng)情期間陰道涂片所見以不規(guī)則、無細(xì)胞核呈落葉狀細(xì)胞為主，為典型的無核角化上皮細(xì)胞。模型組小鼠陰道涂片顯示小鼠動(dòng)情周期紊亂，表現(xiàn)為以有核的白細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞為主。各給藥組小鼠在給藥過程中動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)，漸至穩(wěn)定。

2.2 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢及子宮質(zhì)量的影響

與空白組相比，造模成功后模型組小鼠卵巢以及子宮質(zhì)量均明顯降低(P<0.05)。給藥6周后，雌激素組、毓麟珠各劑量組小鼠卵巢及子宮質(zhì)量均增加，其中毓麟珠高劑量組增加最明顯(P<0.01)，毓麟珠中劑量組及雌激素組次之(P<0.05)，毓麟珠低劑量組僅有上升趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組免疫性POI小鼠卵巢及子宮質(zhì)量比較

2.3 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組小鼠卵泡數(shù)量明顯減少，卵母細(xì)胞部分透明帶縮小，顆粒細(xì)胞排列紊亂，卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整或者縮小。與模型組比較，各給藥組小鼠卵泡數(shù)量增加，卵細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)整，顆粒細(xì)胞排列整齊，其中毓麟珠高劑量組改善最明顯。見圖1。

2.4 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織ROS、GSH-Px、SOD、MDA表達(dá)水平的影響

造模成功后，模型組氧化因子ROS、MDA明顯升高，抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低(P<0.05)；給藥6周后，雌激素組、毓麟珠各劑量組氧化因子ROS、MDA明顯升高，抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低，其中雌激素組效果最為明顯(P<0.01)，毓麟珠高、中、低劑量組效果稍次，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組免疫性POI小鼠卵巢組織中ROS、MDA、GSH-Px、SOD表達(dá)水平比較

2.5 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織Akt蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，Akt蛋白主要分布在卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中。造模后，模型組陽性顆粒明顯較少，著色淺，表達(dá)不明顯；各給藥組陽性顆粒表達(dá)明顯較多，著色深，表達(dá)明顯；在毓麟珠高、中、低劑量組中陽性顆粒的表達(dá)具有明顯的劑量依賴性。見圖2。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。箭頭處為卵泡。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

2.6 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織TSC1、TSC2蛋白表達(dá)的影響

TSC1、TSC2蛋白主要分布在卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中。造模后，模型組陽性顆粒明顯較多，著色深，表達(dá)明顯；各給藥組陽性顆粒表達(dá)明顯較多，著色深，表達(dá)明顯。在毓麟珠高、中、低劑量組中，陽性顆粒的表達(dá)與劑量呈負(fù)相關(guān)。見圖3、圖4。

2.7 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)的影響

造模后，模型組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)；給藥后，各給藥組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)均明顯升高，改善較明顯的是P-4E-BP1蛋白(P<0.01)，而RheB、P-s6k1僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其中毓麟珠高劑量組對RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)改善最明顯。見表3，圖5。

表3 各組免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-sbk1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

研究表明，POI的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)失衡，卵巢內(nèi)部微環(huán)境改變，氧化應(yīng)激增加[8]。而過多的氧自由基(H2O2)可以誘導(dǎo)PI3K表達(dá)的下降[9-10]，PI3K通過磷酸化激活絲氨酸—蘇氨酸激酶Akt[11]，Akt通過磷酸化TSC2來抑制TSC2的活性。TSC復(fù)合物(TSC1/2)是一種抑癌基因，由三個(gè)核心亞基(TSC1、TSC2和TBC1D7)組成，是Rheb的主要上游調(diào)節(jié)因子，其中TSC2可以促進(jìn)Rheb的泛素化，將Rheb從活躍形式轉(zhuǎn)化為不活躍的形式，進(jìn)而抑制mTORC1的活性[12]。P-s6k1、P-4E-BP1處于mTOR的下游，受其調(diào)控，在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄及翻譯方面起著重要作用[5]。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

注：1 空白組；2 模型組；3 雌激素組；4 毓麟珠高劑量組；5 毓麟珠中劑量組；6 毓麟珠低劑量組。

毓麟珠出自《景岳全書·婦人規(guī)》，由八珍湯加菟絲子、杜仲、鹿角霜、川椒化裁而來。該方主治脾腎陽虛導(dǎo)致的不孕，方中四君子湯健脾益氣，使氣血化生有源；四物湯活血為主，養(yǎng)血為輔，使全方補(bǔ)而不滯；菟絲子、鹿角霜、杜仲、花椒溫肝腎，填精血，調(diào)沖任，補(bǔ)命門。全方溫補(bǔ)先天腎氣以生精，培補(bǔ)后天脾胃以補(bǔ)血，佐以活血調(diào)經(jīng)補(bǔ)沖任，既注意腎中陰陽的平衡，又注意用藥的動(dòng)靜結(jié)合，使精氣充盛，沖任通暢，進(jìn)而恢復(fù)生育功能。臨床研究表明，毓麟珠加減能很好地改善脾腎陽虛型卵巢早衰患者的中醫(yī)癥狀，并且降低血清促卵泡生成素、促黃體生成素的水平，并升高雌激素的水平[13]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明毓麟珠能促進(jìn)小鼠卵細(xì)胞成熟，改善卵細(xì)胞質(zhì)量[14]。進(jìn)一步研究表明毓麟珠可以通過改善卵母細(xì)胞線粒體功能，進(jìn)而改善卵母細(xì)胞質(zhì)量與卵巢功能[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)造模后小鼠動(dòng)情周期紊亂，同時(shí)卵巢、子宮質(zhì)量下降，卵泡數(shù)量減少，表現(xiàn)出模型的陽性改變，影響到了小鼠的生殖功能。模型組小鼠卵巢組織ROS、MDA水平相較于空白組明顯升高，GSH-Px、SOD水平相較于空白組降低，說明小鼠卵巢處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；在給予中藥毓麟珠6周之后，模型組小鼠ROS、MDA水平降低，GSH-Px、SOD水平升高，說明毓麟珠可以降低小鼠體內(nèi)活性氧分子水平，同時(shí)提升相關(guān)抗氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明毓麟珠中的多味中藥如熟地、當(dāng)歸、川芎等均能提高體內(nèi)過氧化物歧化酶活性，清除體內(nèi)自由基[16]，毓麟珠的抗氧化活性可能與此相關(guān)。PI3K/Akt信號通路是卵母細(xì)胞內(nèi)與氧化應(yīng)激以及卵泡發(fā)育密切相關(guān)的信號通路[17]，其影響卵泡發(fā)育的原因可能與TSC1/2的磷酸化密切相關(guān)。給予藥物治療后，Akt蛋白表達(dá)明顯升高，抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，Akt表達(dá)的升高會(huì)促進(jìn)TSC2與TSC1分離，結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物(TSC1/2)是抑制mTORC1的主要物質(zhì)，兩者解離則解除對mTORC1的抑制，激活mTORC1[18]，從而使得mTOR信號通路活化。mTOR信號通路下游的P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育[19]。本研究結(jié)果進(jìn)一步分析了Akt/TSC信號通路抑制氧化應(yīng)激改善卵母細(xì)胞質(zhì)量可能與其直接或者間接激活了mTOR信號通路密切相關(guān)。

綜上所述，毓麟珠通過調(diào)控TSC/Akt信號通路抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，可能是減少卵母細(xì)胞以及卵泡損傷，改善卵巢微環(huán)境的重要機(jī)制。接下來的研究將進(jìn)一步探究毓麟珠治療POI的靶標(biāo)，并探究毓麟珠在治療POI過程中發(fā)揮主要作用的有效成份，為臨床中更加精確、有效治療POI提供依據(jù)。