◎ 梁濤波，龍 慧，王 丹，仉 薇，占忠旭，吳 鑫

（1.江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西 南昌 330001；2.南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330038）

阿膠是一種重要的藥食同源物質(zhì)[1]，能用于中藥治療患者，也用于食品領(lǐng)域生產(chǎn)制造各種阿膠制品，如即食阿膠糕、阿膠紅糖茶等。有研究表明，阿膠用于食品生產(chǎn)在加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中容易受到微生物污染[2-3]，尤其是小作坊生產(chǎn)的產(chǎn)品其微生物安全應(yīng)當(dāng)予以重視[4]。根據(jù)近年來的研究調(diào)查顯示，沙門氏菌在1996—2015年引起166起食物中毒事件，造成8 996人感染[5]，金黃色葡萄球菌在2003—2015年引起86起食物中毒事件，造成2 431人感染[6]，這兩種致病菌引起的食品微生物污染尤為嚴(yán)重。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了這兩種病原菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，其中沙門氏菌不得檢出，而且一些阿膠制品的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也有明確規(guī)定。因此，準(zhǔn)確檢測阿膠制品中是否攜帶有活的上述致病菌及其數(shù)量，對(duì)于及時(shí)控制因其導(dǎo)致的感染危害具有重要意義。

目前致病菌活菌檢驗(yàn)最常用的方法是傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法，但該方法程序繁雜、耗時(shí)長，樣本中可能含有雜菌而產(chǎn)生競爭性抑制，也存在對(duì)持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌無法成功培養(yǎng)的缺陷，實(shí)際操作中可能會(huì)發(fā)生漏檢等情況。隨著活菌的快速檢測新技術(shù)不斷出現(xiàn)，研究者們將細(xì)菌是否具有新陳代謝活性進(jìn)而產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，或是否具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)作為判斷活菌的標(biāo)準(zhǔn)，相繼開發(fā)了ATP生物發(fā)光法、免疫學(xué)方法、mRNA檢測法、死菌/活菌熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)以及PCR方法等其他活菌檢測方法[7-8]。近年來，也有研究者將PCR與核酸交聯(lián)染料結(jié)合用于致病菌活菌檢測[9]，其檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且能夠?qū)崿F(xiàn)多重檢測，滿足不同目標(biāo)菌的同時(shí)檢測[10-11]。基于此，本研究根據(jù)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針、優(yōu)化反應(yīng)條件，建立多重?zé)晒舛縋CR檢測體系，并結(jié)合疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）預(yù)處理實(shí)現(xiàn)活菌檢測。本研究建立的PMA-mqPCR為檢測阿膠制品中活的常見致病菌提供了新參考，對(duì)控制阿膠制品的微生物安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腦心浸出液和營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）、Premix Ex Taq?（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）、恒溫水浴鍋（上海智城分析儀器制造有限公司）、高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）和熒光定量PCR儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，CFX96 Touch）。

1.2 菌株和培養(yǎng)

本研究選取了10株標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌，菌株信息及來源見表1，包含目標(biāo)菌4株：沙門氏菌（2株），金黃色葡萄球菌（2株）；非目標(biāo)菌6株：大腸埃希氏菌（2株）、銅綠假單胞菌（1株）、蠟樣芽孢桿菌（1株）、糞腸球菌（1株）和克羅諾桿菌（1株）。所有的菌株分別在腦心浸出液和營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）中進(jìn)行復(fù)蘇和純化培養(yǎng)，然后接種在腦心浸出液中獲取菌懸液。取1 mL細(xì)菌懸液放置在金屬浴中80 ℃熱處理10 min，得到沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的死菌懸液，并進(jìn)行平板涂布，確定不存在活菌。

表1 菌株信息及來源表

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的invA（沙門氏菌）和nuc（金黃色葡萄球菌）序列，使用Beacon designer 8軟件設(shè)計(jì)引物和探針，并通過BLAST進(jìn)行特異性比對(duì)，表2為本研究使用的引物和探針序列，引物和探針序列委托通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

表2 引物和探針序列表

1.4 PMA濃度的優(yōu)化

準(zhǔn)備濃度為1 mg·mL-1的PMA溶液，取不同體積的PMA加入濃度為108CFU·mL-1沙門氏菌和金黃色葡萄球死菌和活菌中，使得PMA終濃度為0 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1和40 μg·mL-1，隨后將其放置在暗處室溫孵育5 min，取出放置在冰盒上，并使用500 W鹵素?zé)粼诰嚯x樣品管20 cm處曝光5 min，其間每隔30 s進(jìn)行輕微振動(dòng)，然后使用1×PBS緩沖液清洗2次，去除多余未交聯(lián)的PMA，最后重懸在200 μL超純水中，并使用水煮法提取基因組DNA[12]。不同濃度PMA處理組獲取的基因組DNA用于qPCR擴(kuò)增，并通過Ct值確定最佳的PMA濃度。

1.5 mqPCR方法的建立

qPCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL Premix Ex Taq?（Takara），0.5～1.0 μL invA-F（10 μmol·L-1）、0.5～1.0 μL invA-R（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL invA-P（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL nuc-F（10 μmol·L-1）、0.5～1.0 μL nuc-R（10 μmol·L-1），0.5～1.0 μL nuc-P（10 μmol·L-1），

DNA模版各2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min 預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 30 s退火和延伸，40個(gè)循環(huán)，在退火和延伸階段采集熒光信號(hào)。通過梯度qPCR優(yōu)化退火和延伸溫度，溫度范圍設(shè)置為55～65 ℃，并根據(jù)不同溫度對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光單位（RFU）大小，確定最佳的退火和延伸溫度。

1.6 靈敏度評(píng)價(jià)

取過夜培養(yǎng)的目標(biāo)菌株，經(jīng)過PMA預(yù)處理后，采用水煮法提取基因組DNA，并使用10倍梯度稀釋法獲取濃度101～108CFU·mL-1的基因組DNA。通過對(duì)目標(biāo)菌基因組DNA進(jìn)行mqPCR，并根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果以Ct值為縱坐標(biāo)，細(xì)菌濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定PMA-mqPCR在純培養(yǎng)液中的檢測靈敏度。

通過對(duì)阿膠制品進(jìn)行加標(biāo)檢測，進(jìn)一步探究PMA-mqPCR方法檢測實(shí)際樣品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的可行性。準(zhǔn)備25 g阿膠制品加入225 mL 1×PBS緩沖液中制成樣品懸液，并且使用培養(yǎng)法確定樣品懸液不存在沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。制備的加標(biāo)樣品懸液分別接種沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，使其終濃度為107CFU·mL-1，然后進(jìn)行PMA預(yù)處理，并使用水煮法提取基因組DNA。通過10倍梯度稀釋獲取不同濃度的基因組DNA，并進(jìn)行mqPCR擴(kuò)增，確定PMA-mqPCR在加標(biāo)樣中的檢測靈敏度。

1.7 特異性評(píng)價(jià)

選取4株目標(biāo)菌、6株非目標(biāo)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲取菌懸液，利用水煮法提取基因組DNA，然后對(duì)基因組DNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，確定方法的特異性。

1.8 活菌檢測

準(zhǔn) 備500 μL濃 度 為107CFU·mL-1沙 門 氏 菌 和金黃色葡萄球菌活菌懸液，分別加入500 μL細(xì)菌濃度為100CFU·mL-1、102CFU·mL-1、104CFU·mL-1、108CFU·mL-1的死菌懸液，制備死活菌混合液，然后進(jìn)行PMA預(yù)處理、基因組DNA提取，最后通過mqPCR擴(kuò)增，比較各組Ct值評(píng)價(jià)活菌檢測性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA濃度的優(yōu)化

PMA濃度是影響活菌檢測的重要條件，合適的濃度能夠最大程度抑制死菌DNA擴(kuò)增，因此本研究探究了PMA濃度對(duì)死菌的抑制效果，優(yōu)化結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1a結(jié)果，當(dāng)PMA濃度從0 μg·mL-1增加到30 μg·mL-1時(shí)，死菌處理組的Ct值逐漸升高，30 μg·mL-1增加到40 μg·mL-1的Ct值趨于穩(wěn)定，圖1b金黃色葡萄球菌PMA處理濃度的優(yōu)化結(jié)果與圖1a結(jié)果相似，綜合考慮抑制死菌DNA最佳擴(kuò)增效果，選取PMA濃度為30 μg·mL-1為最優(yōu)濃度。

圖1 PMA濃度的優(yōu)化結(jié)果圖

2.2 退火溫度的優(yōu)化

反應(yīng)體系的退火溫度是影響qPCR擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素，合適的退火溫度能夠極大地提高擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，為此本研究優(yōu)化了反應(yīng)體系的退火溫度，結(jié)果如圖2所示。圖2a是invA基因（沙門氏菌）退火溫度優(yōu)化的結(jié)果，當(dāng)退火溫度從55.0 ℃到57.0 ℃時(shí)，相對(duì)熒光單位逐漸增加，退火溫度從57.0 ℃到65.0 ℃時(shí)，相對(duì)熒光單位逐漸降低，圖2b是nuc基因（金黃色葡萄球菌）退火溫度優(yōu)化結(jié)果，綜合考慮invA和nuc基因擴(kuò)增的退火溫度優(yōu)化結(jié)果，最終選取57.0 ℃為mqPCR的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果圖

2.3 mqPCR體系的建立

mqPCR體系是多重檢測的基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌同時(shí)檢測提供了可能，體系建立結(jié)果如圖3所示。通過優(yōu)化引物和探針濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，確認(rèn)多重檢測體系為25 μL，包含：12.5 μL Premix Ex Taq?，0.75 μLinvA-F（10 μmol·L-1）、0.75 μLinvA-R（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-P（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-F（10 μmol·L-1）、0.5 μLinvA-R（10 μmol·L-1），0.5 μLinvA-P（10 μmol·L-1），DNA模版各2 μL，超純水5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，57 ℃ 30 s退火和延伸，40個(gè)循環(huán)。

圖3 多重體系的建立圖

2.4 檢測性能

為評(píng)價(jià)PMA-mqPCR同時(shí)檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測性能，本研究對(duì)純菌液中的目標(biāo)菌株進(jìn)行了檢測，以確定方法的檢測靈敏度。純菌液檢測限結(jié)果見圖4a，其中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1，且在102～108CFU·mL-1具有良好的線性相關(guān)性（R2=0.997 5），標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.09x+42.83；金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1，且在101～108CFU·mL-1具 有 良 好 的 線 性 相 關(guān) 性（R2=0.997 2），標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.076x+39.38。

為評(píng)價(jià)PMA-mqPCR檢測實(shí)際樣品的能力，本研究對(duì)阿膠制品進(jìn)行加標(biāo)檢測，以確定該方法的實(shí)際應(yīng)用效果。人工加標(biāo)檢測結(jié)果見圖4b，其中沙門氏菌的檢測限為103CFU·mL-1，且在103～107CFU·mL-1具有良好的線性相關(guān)性（R2=0.998 6），標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.977x+42.86；金黃色葡萄球菌的檢測限為103CFU·mL-1，且 在103～107CFU·mL-1具 有良好的線性相關(guān)性，（R2=0.998 8），標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.468x+48.43。

圖4 檢測限評(píng)價(jià)結(jié)果圖

2.5 特異性評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)PMA-mqPCR檢測不同細(xì)菌的選擇性，本研究選取了4株目標(biāo)菌株，6株非目標(biāo)菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證。特異性結(jié)果如表1所示，其中invA基因只能擴(kuò)增沙門氏菌基因組DNA，非目標(biāo)菌無陽性結(jié)果，nuc基因只能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組DNA，非目標(biāo)菌無陽性結(jié)果。結(jié)果表明，本研究建立的PMA-mqPCR具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地同時(shí)檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

2.6 活菌檢測能力

為探究PMA用于活菌檢測的效果，本研究分別在107CFU·mL-1活菌液中加入等體積的100CFU·mL-1、104CFU·mL-1、106CFU·mL-1和108CFU·mL-1死菌液。活菌檢測結(jié)果如圖5所示，各組Ct值基本持平，其中沙門氏菌活菌回收率為95.70%（104CFU·mL-1）、96.53%（106CFU·mL-1）、105.62%（108CFU·mL-1），金黃色葡萄球菌的回收率分別為100.60%（104CFU·mL-1）、97.63%（106CFU·mL-1）、96.74%（108CFU·mL-1），綜合考慮各組Ct值以及回收率，表明本研究建立的PMA-mqPCR具有較好的活菌檢測效果。

圖5 活菌檢測效果圖

3 結(jié)論和討論

本研究根據(jù)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針，結(jié)合PMA預(yù)處理，建立多重?zé)晒釶CR活菌檢測體系，在最優(yōu)條件下，PMA-mqPCR用于純菌液中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1，金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1，阿膠制品加標(biāo)樣的檢測限均為103CFU·mL-1。通過PMA預(yù)處理，結(jié)合多重?zé)晒鈾z測體系，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)多種致病菌活菌檢測，而且活菌回收率高。

目前致病菌活菌檢測技術(shù)應(yīng)用最廣泛、最簡單的是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，通過一系列的增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定實(shí)現(xiàn)活菌檢測，但這種方法不光費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且對(duì)一些處于非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌無法鑒定[13]。本研究根據(jù)死活菌細(xì)胞膜的完整度不同，利用核酸交聯(lián)染料PMA無法進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌，死菌細(xì)胞膜不完整使得PMA能夠跨過細(xì)胞膜與細(xì)菌基因組DNA發(fā)生不可逆結(jié)合[14]，通過提取細(xì)菌基因組DNA用于qPCR擴(kuò)增，死菌基因組DNA無法成功變性使其不能延伸，而活菌DNA不受影響，實(shí)現(xiàn)活菌檢測。

熒光定量PCR用于致病菌檢測，靶基因的選擇及引物和探針設(shè)計(jì)直接關(guān)系到檢測體系的特異性和靈敏度，選擇合適的靶基因和設(shè)計(jì)適用于多重檢測引物和探針至關(guān)重要。本研究分別選取沙門氏菌invA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因?yàn)榘谢?，其中invA基因編碼沙門氏菌III分泌系統(tǒng)InvA蛋白[15]、nuc基因編碼金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶[16]，并且有研究報(bào)道invA[17]和nuc[18]分別是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因。本研究通過Beacon designer軟件設(shè)計(jì)引物和探針，結(jié)果顯示引物和探針的Tm值均符合多重?zé)晒舛縋CR設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，并且多重檢測體系的建立也進(jìn)一步證明引物和探針設(shè)計(jì)的合理性，為實(shí)現(xiàn)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時(shí)檢測奠定基礎(chǔ)。