◎ 侯笑林，于珺妃

（青島工學(xué)院食品工程學(xué)院，山東 青島 266300）

石榴葉包括熊果酸、甘露醇、沒(méi)食子酸、黃酮苷類等20多種化合物，具有抗心血管疾病、消除自由基及抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、防癌抗癌等作用[1]。黃酮類化合物具有清除氧自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇、抗癌、抗腫瘤作用等多種醫(yī)療保健功能[2]。石榴葉很少被運(yùn)用到生產(chǎn)加工中，少部分被當(dāng)作藥材應(yīng)用，大部分成為廢棄物，資源利用率低。黃酮類物質(zhì)傳統(tǒng)提取方法是乙醇浸提法，但其提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低，且在體外抗氧化性能方面研究較少[3]。本文對(duì)石榴葉黃酮類物質(zhì)的乙醇提取工藝和抗氧化性進(jìn)行了初步試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴葉（郊區(qū)采摘，新鮮無(wú)蟲(chóng)害）；95%乙醇；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；L-抗壞血酸；DPPH；硝酸鋁等。

1.2 設(shè)備

GM-B2002電子天平；DHG-9240A型BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)；多功能粉碎機(jī)；超聲波清洗器；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取流程

石榴葉→洗凈→烘干→粉碎、過(guò)篩→稱取石榴葉粉→按料液比加入乙醇溶液→超聲→離心、抽濾→蒸發(fā)濃縮→乙醇定容→制備黃酮提取液→測(cè)吸光度。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）原料預(yù)處理。挑選新鮮、無(wú)蟲(chóng)蝕石榴葉，洗凈，60 ℃烘干，粉碎，石油醚浸提除去脂溶性雜質(zhì)。脫去石油醚，再次粉碎，過(guò)篩，干燥保存。

（2）石榴葉總黃酮提取。稱取石榴葉粉，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻，保鮮膜封口，一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，離心。濾液用70%乙醇定容，得總黃酮提取液。

1.3.3 石榴葉總黃酮含量測(cè)定及提取率計(jì)算

采用硝酸鋁比色法，以試劑空白為參比，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。吸取待測(cè)液，按上述方法測(cè)吸光度，計(jì)算提取液中總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量。

總黃酮提取率（mg·g-1）=（測(cè)得總黃酮濃度×體積×稀釋倍數(shù)）/石榴葉粉末稱樣量

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g石榴葉粉，按照1∶20料液比分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，60 ℃超聲提取30 min，以總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

（2）料液比對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g石榴葉粉，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30（g·mL-1）加入最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，60 ℃超聲提取30 min，以總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳料液比。

（3）超聲時(shí)間對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g石榴葉粉，按最佳料液比加入最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，提取溫度60 ℃，分別設(shè)定超聲時(shí)間為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，以總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳超聲提取時(shí)間。

（4）超聲溫度對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g石榴葉粉，按最佳料液比加入最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在最佳超聲時(shí)間條件下分別設(shè)置超聲溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，以總黃酮提取率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，確定最佳超聲溫度。

1.3.5 正交試驗(yàn)因素

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取A乙醇體積分?jǐn)?shù)，B料液比，C超聲提取時(shí)間，D超聲提取溫度為4個(gè)影響因素，以總黃酮提取率為測(cè)定指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 石榴葉總黃酮抗氧化性的測(cè)定

（1）羥自由基（?OH）清除率的測(cè)定[4]。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于比色管中，分別加入3 mL 7.5 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、3 mL磷酸鹽緩沖液（pH值=7.4）、2 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4以及2 mL 0.01%雙氧水，混勻，37 ℃水浴30 min，于510 nm處測(cè)吸光值，以相同濃度VC進(jìn)行對(duì)比。羥自由基（?OH）清除率的計(jì)算如下。

清除率P=[1-(Ax-A0)/Ax0]×100%

其中：A0-空白對(duì)照液的吸光度；Ax-加入樣品溶液后的吸光度；Ax0-不加顯色劑H2O2樣品溶液的吸光度。

（2）DPPH自由基清除率的測(cè)定[5]。取不同質(zhì)量濃度樣品溶液4 mL于試管中，依次加入4 mL 0.2 mmol·L-1DPPH溶液，25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在517 nm處測(cè)定吸光度(Ax)。以蒸餾水作為空白。以相同濃度VC進(jìn)行對(duì)比。DPPH自由基清除率的計(jì)算如下。

清除率P=[1-(A1-A2)/A3]×100%

其中：A1-1 mL樣液+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值；A2-1 mL樣液+2 mL95%的乙醇對(duì)應(yīng)吸光度值；A3-1 mL蒸餾水+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取率最大，為5.36 mg·g-1。黃酮由于其極性和化學(xué)性質(zhì)不同，導(dǎo)致部分水溶、部分醇溶，且在體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)均能最大程度溶出。隨后，高濃度乙醇使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，其他醇溶性雜質(zhì)、色素溶出量增加，導(dǎo)致提取率下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為最佳。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響圖

2.2 料液比對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)總黃酮提取率在料液比為1∶15時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，為2.95 mg·g-1。這是因?yàn)殡S著溶劑量的增加，物料與溶劑的接觸面積隨之增加，有效成分濃度降低，與物料及溶劑邊界層的有效成分濃度差增大，擴(kuò)散推動(dòng)力增大，溶出充分。若料液比過(guò)大，雜質(zhì)過(guò)多溶出，提取率降低。因此最佳料液比為1∶15。

圖2 料液比對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響圖

2.3 超聲時(shí)間對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲提取時(shí)間的增加，總黃酮提取率先增大后逐漸減小，當(dāng)超聲提取時(shí)間為20 min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，4.78 mg·g-1。這是由于超聲處理提高了顆粒內(nèi)部的溫度和壓力，使細(xì)胞壁孔徑增加，由內(nèi)而外擴(kuò)散逐漸趨于飽和。但超聲時(shí)間延長(zhǎng)，空化作用、機(jī)械振動(dòng)作用導(dǎo)致細(xì)胞破裂完全，非有效成分進(jìn)入提取液，影響有效成分溶出，同時(shí)熱效應(yīng)致使黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率下降。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響圖

2.4 超聲溫度對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲溫度在70 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高，為3.47 mg·g-1。這是由于隨著超聲溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，有效成分滲透和溶解速度加快，提取率升高；當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，容易造成黃酮類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且雜質(zhì)溶出量增加，給后續(xù)操作帶來(lái)不便，還會(huì)造成溶劑損失。因此超聲溫度應(yīng)控制在70 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)石榴葉總黃酮提取率的影響圖

2.5 正交試驗(yàn)

由表2可知，試驗(yàn)中影響石榴葉總黃酮提取率效果的因素大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲提取時(shí)間＞超聲提取溫度＞料液比，由k值得到的最佳組合為A2B2C3D2；正交試驗(yàn)表得出的最佳組合為A2B2C3D1，故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，在A2B2C3D2組合條件下，得到總黃酮提取率為6.23 mg·g-1，高于A2B2C3D1組合，因此，確定石榴葉總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶15，超聲時(shí)間30 min，提取溫度70 ℃。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.6 石榴葉總黃酮對(duì)·OH清除率的影響

由圖5可知，在0.1～0.6 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，VC與石榴葉總黃酮對(duì)?OH的清除率均隨濃度的增大而升高，且在相同濃度條件下，總黃酮對(duì)?OH清除率均高于VC。當(dāng)總黃酮濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大，為60.94%；之后當(dāng)黃酮濃度繼續(xù)上升，清除率變化不大，而VC對(duì)?OH的清除率在濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)清除率為56.72%，可見(jiàn)石榴葉總黃酮較VC對(duì)?OH清除效果更為明顯。

圖5 石榴葉總黃酮及Vc對(duì)?OH清除率的影響圖

2.7 石榴葉總黃酮對(duì)DPPH·清除率的影響

由 圖6可 知，在0.1～0.6 mg·mL-1濃 度 范 圍內(nèi)，總黃酮與VC對(duì)DPPH?清除率均隨著濃度的增大而升高，抗氧化能力不斷增強(qiáng)。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)，黃酮對(duì)DPPH?的清除率達(dá)到最大，為28.71%，但此時(shí)VC對(duì)DPPH?的清除率可達(dá)38.99%，且在整個(gè)濃度范圍內(nèi)，總黃酮的清除效果均低于VC，可見(jiàn)VC對(duì)DPPH?的清除效果更強(qiáng)。

圖6 石榴葉總黃酮及Vc對(duì)DPPH?清除率的影響圖

3 結(jié)論

以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化石榴葉總黃酮提取工藝，其最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶15，超聲提取時(shí)間30 min、超聲提取溫度70 ℃，石榴葉總黃酮提取率達(dá)6.23 mg·g-1。石榴葉總黃酮對(duì)?OH和DPPH?均表現(xiàn)出一定的清除能力，在一定濃度范圍內(nèi)，清除能力隨著黃酮濃度的增加而增強(qiáng)，且具有明顯的量效關(guān)系；在相同濃度條件下，石榴葉總黃酮對(duì)?OH的清除效果優(yōu)于VC，但對(duì)DPPH?的清除效果低于VC。