吳洪皓，楊 華，吳 鵬

(江西省贛州市中醫(yī)院，江西 贛州 341000)

肺癌(lung cancer)是常見的惡性腫瘤，并且是五年生存率最低的惡性腫瘤之一。本世紀以來，無論在我國還是全世界，肺癌的年發(fā)病人數(shù)、年致死人數(shù)均已躍居第一[1-2]，其全球年發(fā)病人數(shù)180萬，死亡人數(shù)160萬[3]，是嚴重危害人類生命健康的公共衛(wèi)生問題。肺癌可以分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，其中非小細胞肺癌占肺癌的大多數(shù)，而肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小細胞肺癌的三大亞型之一，占總肺癌發(fā)病人數(shù)的40%以上[4]。盡管早期肺腺癌相對容易治療，但肺腺癌發(fā)病較隱匿，大多數(shù)患者就診時已進展到中晚期，癌細胞已經(jīng)發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移，導致肺腺癌成為五年生存率較低的惡性腫瘤之一[5]。靶向治療及免疫治療的應(yīng)用在一定程度上改善了這種現(xiàn)狀，使患者的生存期得到了延長[6-7]，但耐藥以及治療后的轉(zhuǎn)移仍是亟待解決的一大難題。因此探究合適的治療藥物和治療靶點對于肺腺癌的研究和治療意義重大。槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類物質(zhì)，有研究表明其在肺腺癌中有一定治療作用[8]；目前microRNAs(miRNAs)在腫瘤中的研究愈加深入，其中已有大量文獻報道m(xù)iR-29b在腫瘤發(fā)生進程中參與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵作用機制。而槲皮素介導miR-29b在肺腺癌中的調(diào)控機制鮮有報道，因此本研究旨在探究槲皮素通過調(diào)節(jié)miR-29b介導PI3K/Akt信號通路緩解肺癌A549細胞癌變分子機制。

1 材料

1.1 細胞 人肺癌細胞系A(chǔ)549(批號PT-1034，美國模式培養(yǎng)物保藏中心ATCC)，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+8%DMSO培養(yǎng)。

1.2 藥物 槲皮素(純度≥93%，CAS號117-39-5，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，配成20、50、100 μmol/L溶液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Annexin V-FITC/PI(上海碩嘉生物技術(shù)有限公司)；XL型流式細胞儀(美國Beckman Conlter公司)；BPH-9052型細胞培養(yǎng)箱(上海軒儀儀器設(shè)備有限公司)；2D雙向電泳電泳儀(廣州浩翰儀器有限公司)。

1.3.2 試劑 Annexin V-FITC(批號130-092-052)、碘化丙啶PI(批號P8080)、凋亡檢測試劑盒(批號CA1020)(上海恒斐生物科技有限公司)；二甲基亞砜(批號D120527)(上?？泼羯锟萍加邢薰?；CCK8(批號CK04)(北京智杰方遠科技有限公司)；胎牛血清(批號FBS500-S)、RPMI-1640培養(yǎng)基(批號507767)(美國Gibco公司)；兔抗PI3K(批號ab140307)、兔抗Akt(批號ab8805)、兔抗MMP-2(批號ab37150)、兔抗MMP-9(批號ab73734)、兔抗Bcl-2(批號ab182858)、兔抗Bax(批號ab32503)、兔抗GAPDH(批號ab181602)、IgG抗體(批號ab6721)(英國Abcam公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的伯克改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2下孵育。

2.2 分組 取處于對數(shù)生長期A549細胞，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，接種到96孔板，每孔200 μL，實驗分為4組，每組3個復孔，其中對照組為A549細胞，槲皮素低、中、高濃度組濃度分別為20、50、100 μmol/L。

2.3 指標檢測

2.3.1 CCK8法檢測細胞增殖 將細胞以2×103個/孔密度接種到96孔板中，設(shè)置只加培養(yǎng)基不加細胞的空白對照組用于調(diào)零，細胞轉(zhuǎn)染24 h后于24、48、72 h每孔加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃下再孵育4 h，采用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，計算實驗組、對照組吸光度比值，繪制細胞生存能力曲線，重復3次，取平均值。

2.3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞培養(yǎng)后以0.25%胰酶消化各組細胞后，用RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，4 ℃預冷的70%乙醇固定，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，取1 mL細胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每1 mL細胞加2 mL PBS，離心，棄上清，加入預冷的70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜，第2天用PBS洗滌細胞2次，取100 μL細胞懸液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min，100目尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀記錄在488 nm激發(fā)波長處紅色熒光，檢測細胞周期。

2.3.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲水平 細胞培養(yǎng)24 h后，取出-80 ℃保存的基底膠，4 ℃平衡過夜融化成液態(tài)，在200 μL無血清培養(yǎng)基中加入200 μL Matrigel膠，稀釋基質(zhì)膠，Transwell板上室加入50 μL，放入培養(yǎng)箱中，孵育2～3 h待膠成為固態(tài)后消化細胞、計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基配成細胞懸液，每孔上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含有20% FBS條件培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱孵育20～24 h。取出Transwell板，PBS漂洗2次，甲醛固定10 min，再用清水洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置30 min，PBS漂洗2次，棉球擦去上表面的細胞，晾干后用倒置顯微鏡隨機計數(shù)5個視野的細胞，重復3次，取平均值。

2.3.4 RT-qPCR檢測PI3K、AktmRNA、miR-29b表達 采用Trizol提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，體系20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，TaqMan MicroRNA Assay和TaqMan? Universal PCR Master Mix用于RT-qPCR，U6 mRNA水平作為內(nèi)參對結(jié)果進行歸一化，使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進行加樣，樣品在實時熒光定量PCR儀中進行RT-qPCR反應(yīng)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，記錄各孔CT值，mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miRNA以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算產(chǎn)物相對表達量。

2.3.5 Western blot檢測PI3K、Akt和相關(guān)功能蛋白表達 取各細胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將30 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電壓80 V，35 min后120 V電泳45 min，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，傾去封閉液，4 ℃孵育兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗MMP-2、兔抗MMP-9，兔抗Bcl-2、兔抗Bax，兔抗GAPDH，過夜，PBST(含0.1% Tween-20的PBS緩沖液)緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗IgG抗體，室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，于光學發(fā)光儀掃描顯影后，使用Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素抑制A549細胞增殖 與對照組比較，槲皮素組細胞增殖率降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并與其濃度呈負相關(guān)，見表1。

表1 槲皮素對細胞增殖的影響

3.2 槲皮素促進A549細胞凋亡 與對照組比較，槲皮素組細胞G0/G1期細胞增加，S期細胞減少，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并與其濃度呈正相關(guān)，見表2、圖1。

表2 槲皮素對細胞周期的影響

注：A為流式細胞圖，B為流式細胞檢測直方圖。與對照組比較，*P<0.05。圖1 各組細胞周期

3.3 槲皮素抑制A549細胞侵襲 與對照組比較，槲皮素組細胞侵襲水平降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并與其濃度呈負相關(guān)，見圖2。

圖2 各組細胞侵襲(×100)

3.4PI3K、AktmRNA、miR-29b表達 與對照組比較，槲皮素組miR-29b表達升高，并與其濃度呈正相關(guān)；PI3K、AktmRNA表達降低，并與其濃度呈負相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達 與對照組比較，槲皮素組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達降低，并與其濃度負相關(guān)；Bax表達升高，并與其濃度呈正相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖3 各組PI3K、Akt mRNA、miR-29b表達

注：與對照組比較，*P<0.05。圖4 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達

4 討論

槲皮素(quercetin，又名槲皮黃素，C15H10O，相對分子質(zhì)量302.236)是植物界分布廣泛，具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性的黃酮醇類化合物[9]。在腫瘤研究中已有大量文獻報道槲皮素的抗腫瘤作用，Pang等[10]在直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過靶向SLCO1B1并通過使用該化合物產(chǎn)生增強的作用，抑制細胞生長并誘導腫瘤細胞凋亡來降低直腸癌患者的死亡率，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制人皮膚鱗癌癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標記和轉(zhuǎn)移能力，進而達到治療的目的，而在肺腺癌研究領(lǐng)域也有大量關(guān)于槲皮素治療肺腺癌的研究成果，Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素在肺癌細胞中可以抑制HSP70表達，并且與肺癌細胞的生長抑制和對化學治療的敏感性有關(guān)，在肺癌治療中可能具有化學增敏作用。

本次研究中，體外培養(yǎng)肺腺癌A549細胞，用不同濃度(20、50、100 μmol/L)的槲皮素處理，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠降低肺腺癌A549細胞增殖率和侵襲能力，促進肺腺癌A549細胞凋亡。

進一步的研究也發(fā)現(xiàn)了槲皮素能夠在肺腺癌A549細胞中促進miR-29b表達。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了miRNA參與生命過程中許多重要進程，包括生長發(fā)育、疾病發(fā)生，代謝機制，甚至是腫瘤的發(fā)生[13]。Sonoki等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌的研究中，槲皮素可以增加miR-16表達，抑制claudin-2表達從而改善腫瘤進程。Wang等[15]研究也表明，槲皮素可通過調(diào)節(jié)miR-16-5p和WEE1表達增強非小細胞肺癌細胞的放射敏感性。而關(guān)于槲皮素與miR-29b之間的調(diào)控關(guān)系，目前僅有Wang團隊關(guān)于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的有相關(guān)研究[16]。而在腫瘤研究中尚未有相關(guān)報道，本研究的發(fā)現(xiàn)具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。

另外在肺腺癌中槲皮素能夠抑制PI3K/Akt信號通路的激活，Huang等[17]在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt途徑能夠增強癌細胞對順鉑的耐藥性，促進腫瘤細胞的凋亡。有大量研究已經(jīng)證實了PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生過程中扮演的關(guān)鍵角色，探究其在腫瘤發(fā)生進程中介導的調(diào)控機制是腫瘤研究的重要突破點。

本項目結(jié)合中藥有效成分，miRNA以及明星信號通路，研究三者之間的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系以及在肺腺癌腫瘤調(diào)控中發(fā)揮的作用，初步探究槲皮素對肺腺癌A549細胞藥效作用，在臨床應(yīng)用方面有良好的發(fā)展前景和醫(yī)用價值。但是腫瘤發(fā)病機制復雜，本研究得到的結(jié)論應(yīng)用到臨床還需要進一步實驗驗證。