吳洪皓，楊 華，吳 鵬

(江西省贛州市中醫(yī)院，江西 贛州 341000)

肺癌(lung cancer)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，并且是五年生存率最低的惡性腫瘤之一。本世紀(jì)以來(lái)，無(wú)論在我國(guó)還是全世界，肺癌的年發(fā)病人數(shù)、年致死人數(shù)均已躍居第一[1-2]，其全球年發(fā)病人數(shù)180萬(wàn)，死亡人數(shù)160萬(wàn)[3]，是嚴(yán)重危害人類生命健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的大多數(shù)，而肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小細(xì)胞肺癌的三大亞型之一，占總肺癌發(fā)病人數(shù)的40%以上[4]。盡管早期肺腺癌相對(duì)容易治療，但肺腺癌發(fā)病較隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)展到中晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肺腺癌成為五年生存率較低的惡性腫瘤之一[5]。靶向治療及免疫治療的應(yīng)用在一定程度上改善了這種現(xiàn)狀，使患者的生存期得到了延長(zhǎng)[6-7]，但耐藥以及治療后的轉(zhuǎn)移仍是亟待解決的一大難題。因此探究合適的治療藥物和治療靶點(diǎn)對(duì)于肺腺癌的研究和治療意義重大。槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類物質(zhì)，有研究表明其在肺腺癌中有一定治療作用[8]；目前microRNAs(miRNAs)在腫瘤中的研究愈加深入，其中已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-29b在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵作用機(jī)制。而槲皮素介導(dǎo)miR-29b在肺腺癌中的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道，因此本研究旨在探究槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-29b介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路緩解肺癌A549細(xì)胞癌變分子機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(批號(hào)PT-1034，美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心ATCC)，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+8%DMSO培養(yǎng)。

1.2 藥物 槲皮素(純度≥93%，CAS號(hào)117-39-5，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，配成20、50、100 μmol/L溶液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Annexin V-FITC/PI(上海碩嘉生物技術(shù)有限公司)；XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Conlter公司)；BPH-9052型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海軒儀儀器設(shè)備有限公司)；2D雙向電泳電泳儀(廣州浩翰儀器有限公司)。

1.3.2 試劑 Annexin V-FITC(批號(hào)130-092-052)、碘化丙啶PI(批號(hào)P8080)、凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)CA1020)(上海恒斐生物科技有限公司)；二甲基亞砜(批號(hào)D120527)(上?？泼羯锟萍加邢薰?；CCK8(批號(hào)CK04)(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)；胎牛血清(批號(hào)FBS500-S)、RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)507767)(美國(guó)Gibco公司)；兔抗PI3K(批號(hào)ab140307)、兔抗Akt(批號(hào)ab8805)、兔抗MMP-2(批號(hào)ab37150)、兔抗MMP-9(批號(hào)ab73734)、兔抗Bcl-2(批號(hào)ab182858)、兔抗Bax(批號(hào)ab32503)、兔抗GAPDH(批號(hào)ab181602)、IgG抗體(批號(hào)ab6721)(英國(guó)Abcam公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的伯克改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2下孵育。

2.2 分組 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種到96孔板，每孔200 μL，實(shí)驗(yàn)分為4組，每組3個(gè)復(fù)孔，其中對(duì)照組為A549細(xì)胞，槲皮素低、中、高濃度組濃度分別為20、50、100 μmol/L。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以2×103個(gè)/孔密度接種到96孔板中，設(shè)置只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞的空白對(duì)照組用于調(diào)零，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后于24、48、72 h每孔加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃下再孵育4 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組吸光度比值，繪制細(xì)胞生存能力曲線，重復(fù)3次，取平均值。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)后以0.25%胰酶消化各組細(xì)胞后，用RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，取1 mL細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每1 mL細(xì)胞加2 mL PBS，離心，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜，第2天用PBS洗滌細(xì)胞2次，取100 μL細(xì)胞懸液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min，100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀記錄在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處紅色熒光，檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲水平 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取出-80 ℃保存的基底膠，4 ℃平衡過(guò)夜融化成液態(tài)，在200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中加入200 μL Matrigel膠，稀釋基質(zhì)膠，Transwell板上室加入50 μL，放入培養(yǎng)箱中，孵育2～3 h待膠成為固態(tài)后消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)，用無(wú)血清培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，每孔上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含有20% FBS條件培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱孵育20～24 h。取出Transwell板，PBS漂洗2次，甲醛固定10 min，再用清水洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置30 min，PBS漂洗2次，棉球擦去上表面的細(xì)胞，晾干后用倒置顯微鏡隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞，重復(fù)3次，取平均值。

2.3.4 RT-qPCR檢測(cè)PI3K、AktmRNA、miR-29b表達(dá) 采用Trizol提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，體系20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，TaqMan MicroRNA Assay和TaqMan? Universal PCR Master Mix用于RT-qPCR，U6 mRNA水平作為內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化，使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行加樣，樣品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，記錄各孔CT值，mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miRNA以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量。

2.3.5 Western blot檢測(cè)PI3K、Akt和相關(guān)功能蛋白表達(dá) 取各細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將30 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電壓80 V，35 min后120 V電泳45 min，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，傾去封閉液，4 ℃孵育兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗MMP-2、兔抗MMP-9，兔抗Bcl-2、兔抗Bax，兔抗GAPDH，過(guò)夜，PBST(含0.1% Tween-20的PBS緩沖液)緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗IgG抗體，室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，于光學(xué)發(fā)光儀掃描顯影后，使用Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素抑制A549細(xì)胞增殖 與對(duì)照組比較，槲皮素組細(xì)胞增殖率降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并與其濃度呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

3.2 槲皮素促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組比較，槲皮素組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并與其濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響

注：A為流式細(xì)胞圖，B為流式細(xì)胞檢測(cè)直方圖。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖1 各組細(xì)胞周期

3.3 槲皮素抑制A549細(xì)胞侵襲 與對(duì)照組比較，槲皮素組細(xì)胞侵襲水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并與其濃度呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞侵襲(×100)

3.4PI3K、AktmRNA、miR-29b表達(dá) 與對(duì)照組比較，槲皮素組miR-29b表達(dá)升高，并與其濃度呈正相關(guān)；PI3K、AktmRNA表達(dá)降低，并與其濃度呈負(fù)相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，槲皮素組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)降低，并與其濃度負(fù)相關(guān)；Bax表達(dá)升高，并與其濃度呈正相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 各組PI3K、Akt mRNA、miR-29b表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達(dá)

4 討論

槲皮素(quercetin，又名槲皮黃素，C15H10O，相對(duì)分子質(zhì)量302.236)是植物界分布廣泛，具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性的黃酮醇類化合物[9]。在腫瘤研究中已有大量文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素的抗腫瘤作用，Pang等[10]在直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)靶向SLCO1B1并通過(guò)使用該化合物產(chǎn)生增強(qiáng)的作用，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)降低直腸癌患者的死亡率，Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制人皮膚鱗癌癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而達(dá)到治療的目的，而在肺腺癌研究領(lǐng)域也有大量關(guān)于槲皮素治療肺腺癌的研究成果，Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素在肺癌細(xì)胞中可以抑制HSP70表達(dá)，并且與肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和對(duì)化學(xué)治療的敏感性有關(guān)，在肺癌治療中可能具有化學(xué)增敏作用。

本次研究中，體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞，用不同濃度(20、50、100 μmol/L)的槲皮素處理，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠降低肺腺癌A549細(xì)胞增殖率和侵襲能力，促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。

進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)了槲皮素能夠在肺腺癌A549細(xì)胞中促進(jìn)miR-29b表達(dá)。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)了miRNA參與生命過(guò)程中許多重要進(jìn)程，包括生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生，代謝機(jī)制，甚至是腫瘤的發(fā)生[13]。Sonoki等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌的研究中，槲皮素可以增加miR-16表達(dá)，抑制claudin-2表達(dá)從而改善腫瘤進(jìn)程。Wang等[15]研究也表明，槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-16-5p和WEE1表達(dá)增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性。而關(guān)于槲皮素與miR-29b之間的調(diào)控關(guān)系，目前僅有Wang團(tuán)隊(duì)關(guān)于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的有相關(guān)研究[16]。而在腫瘤研究中尚未有相關(guān)報(bào)道，本研究的發(fā)現(xiàn)具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。

另外在肺腺癌中槲皮素能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，Huang等[17]在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt途徑能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有大量研究已經(jīng)證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演的關(guān)鍵角色，探究其在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制是腫瘤研究的重要突破點(diǎn)。

本項(xiàng)目結(jié)合中藥有效成分，miRNA以及明星信號(hào)通路，研究三者之間的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系以及在肺腺癌腫瘤調(diào)控中發(fā)揮的作用，初步探究槲皮素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞藥效作用，在臨床應(yīng)用方面有良好的發(fā)展前景和醫(yī)用價(jià)值。但是腫瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本研究得到的結(jié)論應(yīng)用到臨床還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。