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        槲皮素對(duì)A549細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路及腫瘤惡性特征的調(diào)控機(jī)制

        2021-12-23 11:21:56吳洪皓
        中成藥 2021年12期
        關(guān)鍵詞:槲皮素腺癌批號(hào)

        吳洪皓,楊 華,吳 鵬

        (江西省贛州市中醫(yī)院,江西 贛州 341000)

        肺癌(lung cancer)是常見(jiàn)的惡性腫瘤,并且是五年生存率最低的惡性腫瘤之一。本世紀(jì)以來(lái),無(wú)論在我國(guó)還是全世界,肺癌的年發(fā)病人數(shù)、年致死人數(shù)均已躍居第一[1-2],其全球年發(fā)病人數(shù)180萬(wàn),死亡人數(shù)160萬(wàn)[3],是嚴(yán)重危害人類生命健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類,其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的大多數(shù),而肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小細(xì)胞肺癌的三大亞型之一,占總肺癌發(fā)病人數(shù)的40%以上[4]。盡管早期肺腺癌相對(duì)容易治療,但肺腺癌發(fā)病較隱匿,大多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)展到中晚期,癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致肺腺癌成為五年生存率較低的惡性腫瘤之一[5]。靶向治療及免疫治療的應(yīng)用在一定程度上改善了這種現(xiàn)狀,使患者的生存期得到了延長(zhǎng)[6-7],但耐藥以及治療后的轉(zhuǎn)移仍是亟待解決的一大難題。因此探究合適的治療藥物和治療靶點(diǎn)對(duì)于肺腺癌的研究和治療意義重大。槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類物質(zhì),有研究表明其在肺腺癌中有一定治療作用[8];目前microRNAs(miRNAs)在腫瘤中的研究愈加深入,其中已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-29b在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵作用機(jī)制。而槲皮素介導(dǎo)miR-29b在肺腺癌中的調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道,因此本研究旨在探究槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)miR-29b介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路緩解肺癌A549細(xì)胞癌變分子機(jī)制。

        1 材料

        1.1 細(xì)胞 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(批號(hào)PT-1034,美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心ATCC),用基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+8%DMSO培養(yǎng)。

        1.2 藥物 槲皮素(純度≥93%,CAS號(hào)117-39-5,江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司),溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中,配成20、50、100 μmol/L溶液,在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 儀器與試劑

        1.3.1 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Annexin V-FITC/PI(上海碩嘉生物技術(shù)有限公司);XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Conlter公司);BPH-9052型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海軒儀儀器設(shè)備有限公司);2D雙向電泳電泳儀(廣州浩翰儀器有限公司)。

        1.3.2 試劑 Annexin V-FITC(批號(hào)130-092-052)、碘化丙啶PI(批號(hào)P8080)、凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)CA1020)(上海恒斐生物科技有限公司);二甲基亞砜(批號(hào)D120527)(上??泼羯锟萍加邢薰?;CCK8(批號(hào)CK04)(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司);胎牛血清(批號(hào)FBS500-S)、RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)507767)(美國(guó)Gibco公司);兔抗PI3K(批號(hào)ab140307)、兔抗Akt(批號(hào)ab8805)、兔抗MMP-2(批號(hào)ab37150)、兔抗MMP-9(批號(hào)ab73734)、兔抗Bcl-2(批號(hào)ab182858)、兔抗Bax(批號(hào)ab32503)、兔抗GAPDH(批號(hào)ab181602)、IgG抗體(批號(hào)ab6721)(英國(guó)Abcam公司)。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的伯克改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng),在37 ℃、5%CO2下孵育。

        2.2 分組 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,接種到96孔板,每孔200 μL,實(shí)驗(yàn)分為4組,每組3個(gè)復(fù)孔,其中對(duì)照組為A549細(xì)胞,槲皮素低、中、高濃度組濃度分別為20、50、100 μmol/L。

        2.3 指標(biāo)檢測(cè)

        2.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以2×103個(gè)/孔密度接種到96孔板中,設(shè)置只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞的空白對(duì)照組用于調(diào)零,細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后于24、48、72 h每孔加入10 μL CCK8溶液,在37 ℃下再孵育4 h,采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,計(jì)算實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組吸光度比值,繪制細(xì)胞生存能力曲線,重復(fù)3次,取平均值。

        2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)后以0.25%胰酶消化各組細(xì)胞后,用RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,取1 mL細(xì)胞,1 500 r/min離心10 min,棄上清,每1 mL細(xì)胞加2 mL PBS,離心,棄上清,加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞,4 ℃過(guò)夜,第2天用PBS洗滌細(xì)胞2次,取100 μL細(xì)胞懸液,加入50 μg含RNAase的PI染液,避光30 min,100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,流式細(xì)胞儀記錄在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)處紅色熒光,檢測(cè)細(xì)胞周期。

        2.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲水平 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,取出-80 ℃保存的基底膠,4 ℃平衡過(guò)夜融化成液態(tài),在200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中加入200 μL Matrigel膠,稀釋基質(zhì)膠,Transwell板上室加入50 μL,放入培養(yǎng)箱中,孵育2~3 h待膠成為固態(tài)后消化細(xì)胞、計(jì)數(shù),用無(wú)血清培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液,每孔上室中加入200 μL細(xì)胞懸液,下室中加入600 μL含有20% FBS條件培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)箱孵育20~24 h。取出Transwell板,PBS漂洗2次,甲醛固定10 min,再用清水洗3次,0.1%結(jié)晶紫染色,室溫放置30 min,PBS漂洗2次,棉球擦去上表面的細(xì)胞,晾干后用倒置顯微鏡隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞,重復(fù)3次,取平均值。

        2.3.4 RT-qPCR檢測(cè)PI3K、AktmRNA、miR-29b表達(dá) 采用Trizol提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,體系20 μL,反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA為模板,TaqMan MicroRNA Assay和TaqMan? Universal PCR Master Mix用于RT-qPCR,U6 mRNA水平作為內(nèi)參對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化,使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行加樣,樣品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,記錄各孔CT值,mRNA以GAPDH為內(nèi)參,miRNA以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計(jì)算產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)量。

        2.3.5 Western blot檢測(cè)PI3K、Akt和相關(guān)功能蛋白表達(dá) 取各細(xì)胞提取總蛋白,采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,將30 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒定電壓80 V,35 min后120 V電泳45 min,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,傾去封閉液,4 ℃孵育兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗MMP-2、兔抗MMP-9,兔抗Bcl-2、兔抗Bax,兔抗GAPDH,過(guò)夜,PBST(含0.1% Tween-20的PBS緩沖液)緩沖液洗膜3次,每次10 min,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗IgG抗體,室溫孵育1 h,PBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,于光學(xué)發(fā)光儀掃描顯影后,使用Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

        3 結(jié)果

        3.1 槲皮素抑制A549細(xì)胞增殖 與對(duì)照組比較,槲皮素組細(xì)胞增殖率降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并與其濃度呈負(fù)相關(guān),見(jiàn)表1。

        表1 槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

        3.2 槲皮素促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組比較,槲皮素組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加,S期細(xì)胞減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并與其濃度呈正相關(guān),見(jiàn)表2、圖1。

        表2 槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響

        注:A為流式細(xì)胞圖,B為流式細(xì)胞檢測(cè)直方圖。與對(duì)照組比較,*P<0.05。圖1 各組細(xì)胞周期

        3.3 槲皮素抑制A549細(xì)胞侵襲 與對(duì)照組比較,槲皮素組細(xì)胞侵襲水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并與其濃度呈負(fù)相關(guān),見(jiàn)圖2。

        圖2 各組細(xì)胞侵襲(×100)

        3.4PI3K、AktmRNA、miR-29b表達(dá) 與對(duì)照組比較,槲皮素組miR-29b表達(dá)升高,并與其濃度呈正相關(guān);PI3K、AktmRNA表達(dá)降低,并與其濃度呈負(fù)相關(guān),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

        3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,槲皮素組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)降低,并與其濃度負(fù)相關(guān);Bax表達(dá)升高,并與其濃度呈正相關(guān),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

        注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。圖3 各組PI3K、Akt mRNA、miR-29b表達(dá)

        注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。圖4 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相關(guān)功能蛋白表達(dá)

        4 討論

        槲皮素(quercetin,又名槲皮黃素,C15H10O,相對(duì)分子質(zhì)量302.236)是植物界分布廣泛,具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性的黃酮醇類化合物[9]。在腫瘤研究中已有大量文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素的抗腫瘤作用,Pang等[10]在直腸癌的研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過(guò)靶向SLCO1B1并通過(guò)使用該化合物產(chǎn)生增強(qiáng)的作用,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)降低直腸癌患者的死亡率,Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠抑制人皮膚鱗癌癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記和轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)而達(dá)到治療的目的,而在肺腺癌研究領(lǐng)域也有大量關(guān)于槲皮素治療肺腺癌的研究成果,Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素在肺癌細(xì)胞中可以抑制HSP70表達(dá),并且與肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和對(duì)化學(xué)治療的敏感性有關(guān),在肺癌治療中可能具有化學(xué)增敏作用。

        本次研究中,體外培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞,用不同濃度(20、50、100 μmol/L)的槲皮素處理,檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠降低肺腺癌A549細(xì)胞增殖率和侵襲能力,促進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡。

        進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)了槲皮素能夠在肺腺癌A549細(xì)胞中促進(jìn)miR-29b表達(dá)。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)了miRNA參與生命過(guò)程中許多重要進(jìn)程,包括生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生,代謝機(jī)制,甚至是腫瘤的發(fā)生[13]。Sonoki等[14]研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌的研究中,槲皮素可以增加miR-16表達(dá),抑制claudin-2表達(dá)從而改善腫瘤進(jìn)程。Wang等[15]研究也表明,槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-16-5p和WEE1表達(dá)增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性。而關(guān)于槲皮素與miR-29b之間的調(diào)控關(guān)系,目前僅有Wang團(tuán)隊(duì)關(guān)于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的有相關(guān)研究[16]。而在腫瘤研究中尚未有相關(guān)報(bào)道,本研究的發(fā)現(xiàn)具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。

        另外在肺腺癌中槲皮素能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活,Huang等[17]在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),抑制PI3K/Akt途徑能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有大量研究已經(jīng)證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演的關(guān)鍵角色,探究其在腫瘤發(fā)生進(jìn)程中介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制是腫瘤研究的重要突破點(diǎn)。

        本項(xiàng)目結(jié)合中藥有效成分,miRNA以及明星信號(hào)通路,研究三者之間的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系以及在肺腺癌腫瘤調(diào)控中發(fā)揮的作用,初步探究槲皮素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞藥效作用,在臨床應(yīng)用方面有良好的發(fā)展前景和醫(yī)用價(jià)值。但是腫瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,本研究得到的結(jié)論應(yīng)用到臨床還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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