樊慧杰，李艷榮，柴 智*，劉建春，王新亮，茹 意，尉杰忠，肖保國，馬存根,*

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，山西 晉中 030619；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025)

多發(fā)性硬化是一種慢性炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，常累及脊髓、腦室周圍等部位的白質(zhì)[1]。該病呈全球分布，好發(fā)于青壯年，女性發(fā)病率高于男性，致殘率高，預(yù)后差。多發(fā)性硬化可能與遺傳、免疫、感染等因素有關(guān)，氧化應(yīng)激在發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色。在發(fā)病的初始階段，氧化應(yīng)激通過上調(diào)反應(yīng)性活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平，進(jìn)而破壞血腦屏障，同時使機(jī)體的過氧化產(chǎn)物增多[2]，而過多的過氧化產(chǎn)物比如羰基化蛋白質(zhì)會使病程進(jìn)一步遷延難愈[3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認(rèn)的多發(fā)性硬化實驗動物模型[4]。

五子衍宗丸是臨床常用的補(bǔ)腎良方，現(xiàn)代藥理研究表明，五子衍宗丸不僅能改善生殖功能[5]，而且對神經(jīng)系統(tǒng)有良好的保護(hù)作用。五子衍宗丸的預(yù)先給藥可以有效防治孕鼠胚胎的神經(jīng)管畸形[6-7]。加味五子衍宗丸有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的作用，可能是其發(fā)揮抗癡呆藥理作用的潛在機(jī)制[8]。課題組前期已經(jīng)證實五子衍宗丸對EAE有明確的治療作用[9]，在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)采用EAE模型，以髓鞘脫失、炎性浸潤程度進(jìn)一步明確五子衍宗丸的治療作用，并基于氧化應(yīng)激角度，探討五子衍宗丸治療EAE小鼠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康8～10周齡C57BL/6雌性小鼠30只，體質(zhì)量(19±1)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2020-0006。實驗前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級，通風(fēng)良好，晝夜節(jié)律自然照明，溫度(22±2)℃，相對濕度45%～55%，小鼠自由飲食進(jìn)水。對小鼠的處理過程符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并已經(jīng)通過學(xué)校實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物 五子衍宗丸由北京同仁堂股份有限公司生產(chǎn)(批號18035041)，主要藥材為枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和鹽車前子，輔料是賦形劑蜂蜜，呈棕褐色的水蜜丸，每100粒重10 g，研磨成粉末狀后過篩(0.355 mm)，0.9%氯化鈉溶液溶解粉末配制成混懸液，在4 ℃下貯存?zhèn)溆茫R用前取出回溫并充分混勻。

1.3 儀器 電泳儀(型號PowerPacTM)、凝膠成像分析儀(型號HOOD-Ⅱ)(美國Bio-Rad公司)；冰凍切片機(jī)(型號CM1950，德國Leica公司)。

1.4 試劑 過氧化氫酶(catalase，CAT)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司(批號14097)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)一抗購自美國Novus Biologicals公司(批號NB100-1992)；β-肌動蛋白(β-actin)一抗購自武漢博士德有限公司(批號AA1217B68088Z)；谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號20180102)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(批號20180111)均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為佐劑組、模型組、五子衍宗丸組，每組10只，模型組和五子衍宗丸組小鼠在背部4～5脊椎兩側(cè)分4點進(jìn)針，皮下注射抗原乳劑0.1 mL，由含250 μg髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35～55(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35～55)的磷酸鹽緩沖液和含350 μg結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)按1∶1比例混合而成[10]；佐劑組皮下注射磷酸鹽緩沖液和CFA的1∶1混合乳劑，0.1 mL/只。免疫注射當(dāng)天記錄為免疫第0天，于免疫第0、2天，模型組、五子衍宗丸組小鼠均腹腔注射免疫增強(qiáng)劑百日咳毒素，300 ng/只，而佐劑組小鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

2.2 給藥 五子衍宗丸組小鼠于免疫后第3天灌胃給藥，劑量為16 g/kg[9]，而佐劑組、模型組小鼠均以0.9%氯化鈉溶液灌胃。劑量均為50 mL/kg，每天2次，間隔時間為12 h，持續(xù)25 d(即到免疫后第27天)。

2.3 指標(biāo)檢測 免疫后第28天麻醉、解剖小鼠，心臟灌注0.9%氯化鈉溶液直到肝臟變白，分離脊髓并將其脫水、包埋、液氮冷凍，用于冰凍切片。同時采集每只小鼠腦組織，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測。

2.3.1 固藍(lán)染色 每組取5只小鼠的脊髓冰凍切片，70%乙醇中浸泡15 min，57 ℃固藍(lán)溶液中孵育24 h，依次在95%乙醇、去離子水、0.05%碳酸鋰中浸洗，70%乙醇分化，經(jīng)梯度脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。

2.3.2 HE染色 每組取5只小鼠的脊髓冰凍切片，4%多聚甲醛固定10 min，蘇木素染色12 min，0.1%鹽酸乙醇分化20 s，伊紅溶液染色1 min，乙醇梯度脫水，二甲苯溶液透明，中性樹膠封片，室溫條件下避光晾干，在顯微鏡下觀察拍照。

2.3.3 Western blot檢測SOD、CAT表達(dá) 將小鼠腦組織置于含液氮的研缽中研磨成粉末，取一半加入裂解液，BCA法檢測蛋白濃度，計算SDS-PAGE電泳上樣體積，5%濃縮膠集中，10%分離膠分離，電泳結(jié)束后將凝膠蛋白用半干式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)到PVDF膜(穩(wěn)壓15 V、時間30 min)，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1.5 h，分別加入抗SOD(1∶1 000)、抗CAT(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入羊抗兔辣根過氧化物酶耦聯(lián)二抗(1∶10 000)孵育2 h，洗滌后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，采用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測并拍攝蛋白條帶，通過Image Lab 3.0軟件分析蛋白灰度值。

2.3.4 微量酶標(biāo)法檢測GSH水平 取“2.3.3”項下另一半小鼠研磨腦組織粉末，加入0.9%氯化鈉溶液制成腦組織勻漿液，采用酶標(biāo)儀檢測405 nm波長處吸光度，計算腦組織中GSH水平，具體步驟參照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3.5 比色法檢測MDA水平 取“2.3.4”項下小鼠腦組織勻漿液，采用酶標(biāo)儀檢測532 nm波長處吸光度，計算腦組織中MDA水平，具體步驟參照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 五子衍宗丸抑制EAE小鼠的髓鞘脫失 圖1顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠脊髓白質(zhì)呈現(xiàn)大范圍髓鞘脫失(P<0.01)，表明模型制備成功；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠脊髓白質(zhì)髓鞘脫失范圍減少(P<0.01)。

注：A為脊髓固藍(lán)染色，B為脊髓白質(zhì)髓鞘脫失面積占比。與佐劑組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖1 各組小鼠脊髓白質(zhì)髓鞘脫失情況

3.2 五子衍宗丸減輕EAE小鼠脊髓的炎性細(xì)胞浸潤 圖2顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠脊髓白質(zhì)呈現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠脊髓白質(zhì)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01)。

注：A為脊髓HE染色，B為脊髓炎性浸潤灶占比。與佐劑組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖2 各組小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤情況

3.3 五子衍宗丸對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 圖3顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠腦組織CAT表達(dá)降低(P<0.05)，SOD表達(dá)呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠腦組織CAT、SOD表達(dá)升高(P<0.01)。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為不同組別CAT、SOD蛋白表達(dá)統(tǒng)計圖。與佐劑組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01。圖3 各組小鼠腦組織CAT、SOD表達(dá)

圖4顯示，與佐劑組比較，模型組小鼠腦組織GSH水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，五子衍宗丸組小鼠GSH水平升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)。

注：與佐劑組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。圖4 各組小鼠腦組織GSH、MDA水平

4 討論

近年來，研究者們?nèi)找骊P(guān)注到氧化應(yīng)激機(jī)制在多發(fā)性硬化發(fā)病中的重要性[11]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體就有ROS等自由基的產(chǎn)生，也有抗氧化體系如CAT、SOD、GSH等發(fā)揮抗氧化的作用，氧化與抗氧化維持在一個動態(tài)平衡中。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧的需求量大以及自由基的清除能力弱，所以大腦、脊髓比其它組織器官更容易受到自由基的攻擊[11]；在多發(fā)性硬化病變中神經(jīng)元就有大量的ROS產(chǎn)生，使氧化—抗氧化體系向氧化損傷一方傾斜[12]。脂類是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的主要成分，約占髓鞘干重的70%，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS等過多的自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，有研究表明大量的自由基可能是多發(fā)性硬化神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的原因之一[13]。氧化應(yīng)激引起的髓鞘受損，將加劇炎性細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，擴(kuò)大機(jī)體的炎癥反應(yīng)[14]。所以減輕多發(fā)性硬化的氧化應(yīng)激損傷程度，是延緩其進(jìn)展的熱門靶點。

在國家中醫(yī)藥管理局制定的疾病中醫(yī)治療的方案中，將多發(fā)性硬化以“痿病”來表述[15]。關(guān)于多發(fā)性硬化病因病機(jī)與病位的認(rèn)識，雖然各中醫(yī)學(xué)者的觀點不統(tǒng)一，但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多發(fā)性硬化是腎虛為本，濕熱濁毒為標(biāo)的疾病[16-17]?！叭耸忌?，先成精，精成而腦髓生”是中醫(yī)認(rèn)識多發(fā)性硬化的理論基礎(chǔ)，若腎精虧損，則髓海不足。所以在多發(fā)性硬化的臨床中藥治療中多體現(xiàn)了補(bǔ)腎固髓的思想[17]。五子衍宗丸是至今仍在臨床上廣泛應(yīng)用的補(bǔ)腎固精之良方。有研究表明，五子衍宗丸還可以改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，同時提升其免疫水平，具體機(jī)制可能與五子衍宗丸增強(qiáng)衰老小鼠的抗氧化能力有關(guān)[18]。五子衍宗丸及其拆方的單味中藥枸杞子、菟絲子對老年大鼠腦和心臟組織線粒體DNA的氧化損傷均具有保護(hù)作用[19]。單味中藥五味子通過提高SOD、GSH的水平，可以減輕氧化損傷，進(jìn)而維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[20]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步明確五子衍宗丸對EAE的治療作用，五子衍宗丸可以減輕EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘反應(yīng)，減少炎性細(xì)胞的浸潤，具體機(jī)制可能與SOD及CAT蛋白表達(dá)的上調(diào)、GSH水平增加、MDA水平降低相關(guān)，使氧化應(yīng)激損傷程度減輕，從而對EAE小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用。

本研究將為五子衍宗丸推廣到臨床治療多發(fā)性硬化提供科學(xué)思路和實驗依據(jù)，有助于開發(fā)五子衍宗丸的老藥新用領(lǐng)域，使五子衍宗丸擁有更為廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>