李林玉 張玉婷 朱芝宜 李培根 琚淑明

(徐州工程學(xué)院 環(huán)境學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

菌種優(yōu)劣在微生物防治工作研究中占有重要地位，自然界中，野生菌株的種類多樣，資源豐富，但因產(chǎn)率低，性狀不夠良好等原因不能直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，需要通過菌種選育，擇高產(chǎn)優(yōu)良菌株。生物防治技術(shù)對高產(chǎn)功能菌株的迫切需求與微生物制藥工業(yè)創(chuàng)新生產(chǎn)帶動了各選育技術(shù)的蓬勃發(fā)展。在最近的育種研究中發(fā)現(xiàn)有些突變株可代謝產(chǎn)生新產(chǎn)物，這些新產(chǎn)物在醫(yī)藥等方面具有新的潛在應(yīng)用前景，這就使得育種技術(shù)拓展了新的應(yīng)用研究發(fā)展空間[1]。

1 誘變育種

基因突變是微生物變異的主要形式。人工誘變是加速基因突變的重要手段[2-4]。誘變育種是現(xiàn)階段最重要、運用最廣泛的菌種選育方法，它具有變異速度快、成本低、收益大、操作簡單、輻射范圍廣等優(yōu)點。目前應(yīng)用于微生物誘變育種的誘變劑主要有物理誘變劑、化學(xué)誘變劑、生物誘變劑以及其他新型誘變劑[5]。誘變育種存在一定的盲目性與隨機性[6]，很難準確高效地篩選出有效菌株。如何提高誘變育種的準確性與可控性已成為現(xiàn)階段誘變育種研究不可忽視的問題。

1.1 物理誘變

物理誘變一般包括紫外誘變、太空誘變、微波誘變、激光電離、輻射、等離子誘變等[7-9]。其中紫外誘變因具有變異率高、操作簡單、成本低等優(yōu)點成為目前應(yīng)用最廣泛的物理誘變技術(shù)[10]。1941年Beadle和Tatum利用物理誘變技術(shù)處理紅色面包霉獲得代謝障礙得到明顯改善的突變株，至此誘變育種技術(shù)開始快速發(fā)展。紫外誘變育種的特點是DNA在紫外區(qū)域吸收光峰值高，易形成嘧啶二聚體，它會阻礙DNA雙鏈解旋和堿基配對，導(dǎo)致DNA鏈不能正常復(fù)制，以此誘發(fā)誘變材料發(fā)生嚴重基因突變，使誘變材料產(chǎn)生嚴重損害甚至死亡[11]。其遺傳效應(yīng)主要是引起GC - AT的轉(zhuǎn)換或移碼突變[12]。雖然紫外誘變目前應(yīng)用較廣泛，但它在某些方面仍存在工作量較大、變異方向較隨機可用變異株較少、資源大量浪費等問題，所以紫外誘變同其他誘變方法結(jié)合應(yīng)用應(yīng)當是未來菌種選育技術(shù)發(fā)展的重要方向之一[12]。

1.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是一種傳統(tǒng)且經(jīng)典的微生物育種技術(shù)，也是國內(nèi)目前常見的誘變方法[13]。其主要是借助化學(xué)誘變劑來實現(xiàn)對菌種的誘變選育。化學(xué)誘變劑種類多樣，且都具有專一性，即一種誘變劑只針對個體基因的某一個部位發(fā)生作用，對其他部位沒有影響[14-17]。化學(xué)誘變不受遺傳背景和代謝途徑的影響，誘變劑獲取相對方便，操作簡便，價格便宜，但具有一定的盲目性和隨機性。顧真榮等[19]利用吖啶橙處理枯草芽孢桿菌 G3，得到各性狀更為優(yōu)秀的突變株。迄今化學(xué)誘變育種研究多采用組合2種或2種以上誘變因子的復(fù)合誘變方法對微生物群體進行處理來使突變率提高，增加獲得正向突變的概率[18]。但如何利用此方法更高效快速地獲得目的菌株仍然需要大量的研究探索。

1.3 復(fù)合誘變

復(fù)合誘變是指將不同的兩種或兩種以上誘變因子結(jié)合起來獲得性狀優(yōu)良的功能菌株。目前單一的誘變育種方式由于產(chǎn)生的變異種類過于單一而很少能得到性狀十分優(yōu)良的菌株或者誘變得到的突變株的性狀不能穩(wěn)定遺傳。復(fù)合誘變育種相比單一誘變具有協(xié)同效應(yīng)，即至少能夠產(chǎn)生兩種不同的變異類型，可以從一定程度上彌補單一誘變的缺陷，以便獲得性狀優(yōu)良菌株，這是復(fù)合誘變的一大優(yōu)勢，目前復(fù)合誘變在各個行業(yè)應(yīng)用相當廣泛。Ellaiah等[20]通過紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變得到 1株高產(chǎn)頭孢菌素 C 突變株。于航等[21]利用DES 與紫外線進行復(fù)合誘變，獲得一株色素含量低、出芽較短、梗霉的變異菌株。

2 雜交育種

雜交育種是以基因組為基礎(chǔ)，選取遺傳性狀差異較大的菌株作為親本，通過一系列方法使親本發(fā)生基因重組，最終將親代的某些優(yōu)良特性集中反映在后代菌株上且剔除親本的某些不良性狀[22]。1979年P(guān)esti首先在工業(yè)微生物育種行業(yè)采用雜交育種技術(shù)來提高青霉素的產(chǎn)量。雜交育種可分為原生質(zhì)體融合和常規(guī)個細胞融合兩大類。其中原生質(zhì)體融合因其親本的融合可選性更多，親本重組幾率更高等優(yōu)點成為雜交育種的重要技術(shù)手段[22-29]。隨著生物技術(shù)的研究不斷深入，原生質(zhì)體融合技術(shù)成功打破了傳統(tǒng)意義上微生物種間的界限，實現(xiàn)了遠緣菌株的基因重組，為現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)培育優(yōu)良品質(zhì)菌株提供新的技術(shù)[30]。但對于雜交育種而言，無論是提供目的菌株供體菌，還是接受目的菌株受體菌，均為已知，且育種過程相當復(fù)雜緩慢，所以該技術(shù)具有較為理想的方向性與可控性，但缺少變異性、便捷性與創(chuàng)新性。

3 基因工程育種

基因工程育種[31]是目前最先進的微生物菌種選育技術(shù)。它綜合了分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和微生物遺傳學(xué)等學(xué)科知識，是按照人類的意愿預(yù)設(shè)基因改造方向，得到理想突變菌種的育種技術(shù)。目前，此項技術(shù)已成功應(yīng)用于麻脫膠菌種選育和遺傳，改良提升頭孢菌素、酶制劑等的產(chǎn)量，改善傳統(tǒng)發(fā)酵業(yè)功能菌株與工業(yè)污物廢水處理菌的選育。雖然此方式在微生物選育中存在操作復(fù)雜、成本較高、選育菌種穩(wěn)定性差等問題，但它可以完全突破物種間的障礙，真正打破了傳統(tǒng)意義上的育種方法，實現(xiàn)遠緣雜交，前景廣闊[23]。

4 進化工程育種

進化工程育種(evolutionary engineering breeding)是通過模擬自然進化中的變異和選擇過程，在人工選擇的壓力下促使微生物的進化，最后從進化菌群中篩選出性狀優(yōu)良的功能菌株并將其合理保留的方法，是進化論思想在生物工程中的一種應(yīng)用[32]。進化工程育種技術(shù)選擇出的菌株不僅在選擇壓力環(huán)境下能夠適應(yīng)，而且在選擇壓力下群體中微生物之間的競爭中有較強的競爭力，同時它降低對特定菌種選擇的時間，提高目的菌株的穩(wěn)定性。但目前人們對進化工程育種技術(shù)的理解還比較淺顯，未來還需更多的研究實驗來將其完善。

5 結(jié)論與展望

現(xiàn)階段對于如何進行菌種選育已經(jīng)有了很多種方法，但運用到實際生產(chǎn)中卻存在不少的問題。就目前我國掌握的菌種選育的方式來說，絕大多數(shù)存在可控性差、育種時間長、育種方向不穩(wěn)定等問題，因此如何更高效地獲得目的菌株已成為現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中不可避免的問題。從以上綜述可得出，菌種選育的研究，是一項長期且艱難的任務(wù)。如何改良現(xiàn)階段已知的選育方式，如何將現(xiàn)有的單一選育方式結(jié)合起來以及探索新型選育方式都是未來需要解決的難題。