趙一霖 王皓潔 綜述 詹江華 審校

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）以肝內外膽管進行性炎癥及肝纖維化為特征，黃疸進行性加重為主要臨床表現(xiàn)。病因尚不明確，與病毒感染、免疫反應關系密切［1，2］。BA診斷后應先行Kasai手術，部分患者恢復膽流后，肝纖維化并沒有停止，自體肝生存率較低，最終需要通過肝移植來挽救生命［3］。延緩甚至逆轉肝纖維化是治療BA的重要環(huán)節(jié)。有研究證實，BA肝纖維化與膽管上皮細胞發(fā)生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關［4］。EMT是指分化成熟的極化上皮細胞在外界因素的刺激下，獲得某些間質細胞的特征，使其具有更強的活性和遷移性，可促使實質器官纖維化［5，6］。TGFβ1是多功能超家族一員，可影響細胞分化及細胞生長。TGFβ1在肝臟中表達較多，可引起肝臟中肝細胞、肝星狀細胞、膽管上皮細胞發(fā)生EMT，促進肝纖維化［7-9］。研究表明，TGFβ1可通過誘導EMT促進BA肝纖維化進展［10-12］。肝纖維化的程度、肝內膽管閉鎖程度是治療膽道閉鎖重要條件。Kasai術后，持續(xù)進展性肝纖維化是影響自體肝生存率的重要因素，延緩肝纖維化的進程在BA治療中起到非常關鍵的作用［3］。

一、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）

TGFβ是超因子家族中的一員，對細胞分化、細胞增生、胚胎發(fā)生、細胞凋亡等許多細胞反應有重要作用［7］。TGFβ是一種分泌型同型二聚體蛋白，內含兩個亞基，每個亞基含有112個氨基酸。保守的Cys殘基形成的分子間二硫鍵將兩個亞基連接成二聚體蛋白［7，13］。TGFβ共有六種亞型：TGFβ1～TGFβ6。TGFβ1在肝臟中活性最高，可被缺氧、細胞外脂蛋白等刺激激活，對肝纖維化、腫瘤進展有重要作用［14］。在BA肝內膽管纖維化中，可檢測到TGFβ1的異常升高［7］。實驗證明，在BA肝纖維化中，膽管上皮細胞TGFβ1與EMT標記因子增多［11］。由此可知，TGFβ1可誘導膽管上皮細胞上皮-間質轉化，促進BA肝纖維化。TGFβ1的相關受體（transforming growth factor-β1 receptor，TβR）、TβRⅠ/TβRⅡ復合物與TGFβ1結合，刺激Smad 2/Smad 3復合物形成，促進EMT進程［7，9］。

二、上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT是指在外界因素的刺激下，成熟的極化上皮細胞間連接逐漸松解向紡錘體形狀的間質細胞轉化，轉化后細胞具有間質細胞特征，有更強的活性和遷移性，可參與器官纖維化、組織愈合、癌癥遷移等過程［5，6，10，15］。隨著間質細胞轉化增多，上皮細胞標志因子如E-鈣黏蛋白、α-連環(huán)素等會逐漸下調，α-SMA、成纖維細胞特異性蛋白-1、波形蛋白等間質細胞標志因子上調。其中E-鈣黏蛋白是上皮細胞間緊密結合的重要角色，E-鈣黏蛋白的減少促進上皮組織松解，有利于向間質細胞轉化［6，16］。Zeisberg、Deng等［16，17］實驗表明，肝星狀細胞、肝細胞可發(fā)生EMT。EMT可引起肝纖維化，在BA中也有相關報道［4，7，18］。在Deng等［19］的實驗中通過免疫組化、雙標記免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)間質細胞相關因子S100A4及上皮細胞相關因子CK-7在BA纖維化膽管上皮細胞中共表達，且S100A4表達的升高與CK-7降低有關；S100A4與膠原標記物HSP47在BA中也存在共表達細胞。Xiao等［20］發(fā)現(xiàn)TGFβ1誘導BA肝纖維化后，CK-7與α-SMA共表達于膽管上皮細胞，隨著肝纖維化加重，共表達細胞逐漸減少，表達α-SMA細胞逐漸增多，提示間質細胞比例升高。膽道結扎小鼠模型中同樣發(fā)現(xiàn)EMT過程，伴隨梗阻逐漸加重，間質細胞標記因子α-SMA在14～21d呈現(xiàn)一個峰值［21］。EMT過程通過促進間質細胞增多使細胞外基質（extracellular matrix，ECM）不斷沉積，逐漸導致肝纖維化［5，7，22］。若能夠有效抑制或者逆轉EMT進程，將很好地緩解甚至逆轉BA肝纖維化，為提高患者自體肝生存率帶來希望。

三、TGFβ1誘導EMT相關通路與肝纖維化關系

（一）TGFβ1/Smad通路

TGFβ1/Smad通路可誘導EMT產(chǎn)生。轉化生長因子-β1受體Ⅰ（transforming growth factor-β1 receptorⅠ，TβRⅠ）、轉化生長因子-β1受體Ⅱ（transforming growth factor-β1 receptorⅡ，TβRⅡ）在人類基因組中由5～7個基因編碼，由相似的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶構成。TβRⅠ前二聚體與TβRⅡ二聚體形成的異四聚體具有活化功能。在各種因素刺激下，TGFβ1與TβRⅠ/TβRⅡ復合物相連接，在富含甘氨酸、絲氨酸殘基的近膜域中，TβRⅡ激酶將胞漿內Ⅰ型受體中的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化后的殘基區(qū)域募集Smad 2/Smad 3復合物。TβRⅠ將募集的Smad 2/Smad 3復合物磷酸化，形成磷酸化-Smad 2/3（p-Smad 2/3）［10，13，22］。p-Smad 2/3逐漸向Smad 4蛋白處移動形成Smad 2/3/4復合物且不斷堆積。Smad 4蛋白MH1結構域（N-末端結構域，MH1）上的氮端核定位信號進入細胞核，Smad 2/3/4復合物與特定的DNA具有高度的轉錄調控功能，促進間質細胞轉錄因子增多，例如Snail、Twist等相關轉化因子，從而促進間質細胞生成［7，8，10，13］。間質細胞增多促進纖維組織表達，使ECM不斷沉積，促進肝纖維化。丁美云等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在BA肝纖維化早期，TGFβ1、Smad2mRNA表達較膽管擴張組明顯增高，提示TGFβ1/Smad信號通路參與BA肝纖維化過程。

EMT轉錄過程可被微小RNA（microRNA，miRNA）影響［25］。在肝臟腫瘤中，miR-542-3-p可以影響TGF-β1/Smad信號通路［26］。BA肝纖維化中同樣存在miRNA促進或抑制EMT的情況［22］；miR-29c可以有效抑制小鼠膽管細胞中TGFβ1誘導EMT［12］；miR-200b可以通過抑制E-鈣黏蛋白阻遏物鋅指蛋白1促進E-鈣黏蛋白的生成，進而阻抑EMT，減緩肝纖維化［20］。

（二）TGFβ1/ERK通路

細胞外信號調節(jié)激酶2（extracellular regulated protein kinase 2，ERK2）屬絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，還包括p38和c-Jun氨基末端激酶2（c-Jun N-terminal kinase 2，JNK2）等，是參與生長、分化和凋亡等多種細胞過程的信號通路。

相關實驗發(fā)現(xiàn)，ERK2與JNK2在BA組織匯管區(qū)及膽管上皮細胞中均呈陽性表達［27］。在TGFβ1誘導EMT的過程中，不僅可激活依賴Smad信號通路，還可激活非依賴Smad信號通路。ERK可以通過阻斷Smad2/3復合物磷酸化及Smad4核易位過程，進而影響TGFβ1/Smad通路發(fā)生EMT［28］。

誘導產(chǎn)生EMT的TGFβ1/ERK獨立信號通路，可直接通過ERK不依賴Smad引起EMT。有關研究顯示抑制ERK信號通路可抑制EMT進程［29］。ERK參與肝臟腫瘤細胞EMT的過程中，HepG2細胞預先被MEK1/2抑制劑處理，TGFβ1誘導之后EMT標志物波形蛋白的分泌明顯減少，說明MEK1/2對肝腫瘤細胞EMT有重要影響，推測TGFβ1在肝臟細胞誘導EMT過程存在MEK-ERK通路的參與［27］。有研究表明在BA中輪狀病毒（rhesus rotavirus，RRV）可激活MAPK通路，ERK1/2、JNK1/2磷酸化成倍數(shù)增加，會促進病毒的復制，加劇膽管的損傷［30］。其引起膽管損傷的過程可能與BA纖維化中膽管上皮的纖維化過程有關。Lobeck等［31］的實驗表明，ERK通路參與RRV在膽管細胞中的復制。感染RRV之后的BALB/C小鼠用ERK激活抑制肽Ⅰ處理，結果有66.7%的小鼠出現(xiàn)膽道梗阻癥狀，而對照組（生理鹽水組）出現(xiàn)梗阻癥狀的比例為100%，21 d死亡率也隨著ERK被抑制而降低，提示ERK參與BA肝纖維化過程。ERK在TGFβ1的誘導下可使肝臟腫瘤細胞發(fā)生EMT，在BA中對纖維化同樣有重要作用，其在BA中的相關機制尚需進一步探索。

（三）TGFβ1/STAT3信號通路

信號轉換及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）與惡性腫瘤、細胞轉化、EMT有關。在肺癌和卵巢腫瘤中STAT3可在JAK激酶（janus kinase，JAK）誘導下參與EMT過程，參與腫瘤細胞的侵襲和轉移［32］。

在Lin等［33］的實驗中，利用Western及免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)TGFβ1刺激后肝臟細胞中的波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達上調，而E-鈣黏蛋白的表達下調；同時發(fā)現(xiàn)p-JAK、p-STAT3、Twist表達增多；而STAT3抑制劑AG490作用于TGFβ1誘導的腫瘤細胞后，其間質細胞標志因子表達減少。其實驗表明STAT3、JAK、Twist在TGFβ1的刺激下參與肝臟腫瘤細胞的EMT進程。Wang等［34］的實驗中發(fā)現(xiàn)TGFβ1誘導肝臟腫瘤細胞之后，STAT3、p-STAT3及波形蛋白的表達上調。在EMT過程中，TGFβ1激活JAK，激活的JAK收集STAT3單體產(chǎn)生同源或異源二聚體；隨后，細胞核和特定DNA序列調節(jié)靶基因的轉錄，其過程與Twist有關［29，33］。在Luo等［35］的實驗中，通過建立基因數(shù)據(jù)庫及進行相關實驗，發(fā)現(xiàn)BA、原發(fā)性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎中存在包括STAT3在內的共同基因。Xiao等［36］的實驗顯示在BA肝組織免疫組化后可見p-STAT3核染色，提示STAT3參與BA肝纖維化過程。BA EMT進程還可由非TGFβ1誘導產(chǎn)生，如Notch通路、Hh信號通路、Wnt通路等［37，38］。

四、展望

Kasai手術的廣泛開展使BA患者獲得更多的生存機會，但肝纖維化仍可持續(xù)進展，故自體肝生存率較低，肝移植率較高。有效緩解甚至逆轉肝纖維化是改善BA自體肝生存率的重要條件。TGFβ1可通過Smad以及不依賴Smad信號通路誘導EMT發(fā)生，促進肝纖維化進程。抑制EMT過程可緩解BA肝纖維化，然而抑制TGFβ1的做法并不可取，TGFβ1除誘導EMT外，在炎癥抑制、免疫調節(jié)等多個方面發(fā)揮重要作用，抑制TGFβ1會同時抑制體內其他反應。抑制通路中的相關因子也可以抑制EMT進程。miR-200b等相關miRNA可抑制甚至逆轉EMT，其在肝臟腫瘤細胞中研究較多，可為進一步拓展研究提供思路。間質細胞標記因子在纖維化過程中存在一個峰值，說明在肝纖維化過程中，可能存在EMT過程較活躍的特殊時期，此時抑制通路相關因子延緩肝纖維化更加容易。目前BA肝纖維化相關通路研究遠不及其他肝臟疾病，其誘導EMT相關信號通路尚不明確。延緩纖維化過程除作用于轉錄因子外，是否可以通過作用其細胞膜中TGFβ1相關受體而不影響TGFβ1在體內的其他重要功能，或特異性截斷信號自胞漿向細胞核中轉導的過程來實現(xiàn)減緩肝纖維化的作用，還有待發(fā)現(xiàn)更多特異性的相關因子來實現(xiàn)。