周翠燕，俞敏達，李文奇

(1.清華大學 生命科學與醫(yī)學研究院，北京 100084; 2.國家蛋白質(zhì)科學研究(北京)設施清華基地，北京 100084; 3.清華大學 生命科學學院， 北京 100084； 4.清華大學 結構生物學高精尖創(chuàng)新中心，北京 100084; 5.北京市第四中學國際校區(qū)，北京 100032)

蛋白質(zhì)在加熱過程中會發(fā)生熱變性解折疊，蛋白質(zhì)的熱變性中點溫度(melting temperature，Tm)是指在蛋白質(zhì)解折疊50%時對應的溫度[1].蛋白質(zhì)的熱變性過程與其空間構象的改變密切相關，Tm值能反映變溫過程中蛋白質(zhì)構象改變的趨勢，是衡量蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個重要指標[2].蛋白質(zhì)Tm值的測定在生物醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用，如嗜熱蛋白、工業(yè)酶等的改造與篩選[3]，蛋白質(zhì)藥物與配體、制劑或輔料的相互作用，蛋白質(zhì)藥物的緩沖液穩(wěn)定條件篩選等[4].目前，常用的蛋白質(zhì)Tm值的測定方法有差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)、圓二色光譜法(circular dichroism，CD)和差示掃描熒光法(differential scanning fluorimetry，DSF)等.

差示掃描量熱法的應用始于20世紀60年代，是在程序控溫下，通過測量輸給待測物和參比物的功率差與溫度的關系，以獲得吸放熱量的技術[5].差示掃描量熱法能定量測量熱力學參數(shù)，可提供與蛋白質(zhì)熱變性過程中構象變化有關的熱效應信息[4, 6-7].圓二色譜法同樣誕生于20世紀60年代，其原理是利用左、右兩束偏振光透過具有手性結構的生物大分子等活性介質(zhì)，獲得的圓二色譜來分析其結構特點，是蛋白質(zhì)、核酸、糖類等生物大分子二級結構分析的常規(guī)手段之一[8].變溫過程中測量蛋白等物質(zhì)的圓二色譜，能反映其隨溫度升高結構變化的趨勢，所以圓二色譜法也是測定蛋白質(zhì)Tm值的有效方法[9].差示掃描熒光法(也被稱作ThermoFluor)出現(xiàn)于2001年，Pantoliano等[10]最先應用此技術測定了上百種蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性.差示掃描熒光法分為添加外源熒光染料與不添加熒光染料兩種方式，都是利用加熱使蛋白內(nèi)部疏水基團暴露這一特點進行檢測.前者通過添加與蛋白疏水部分親和而產(chǎn)生熒光信號的染料，追蹤記錄變溫過程中熒光信號的變化曲線來測定Tm值，后者則是通過檢測蛋白去折疊過程中帶有熒光生色基團的芳香族氨基酸(色氨酸和酪氨酸)所處疏水環(huán)境的變化來檢測Tm值.

為了比較這三種廣泛應用的蛋白質(zhì)Tm值測定方法的檢測特點和檢測效果，本文選擇了5種具有不同結構特點的蛋白質(zhì)進行分析.單結構域單體的arabidopsis pyrabactin resistant like 10(PYL 10)、單結構域同源二聚體的arabidopsis pyrabactin resistant like 2(PYL 2)、多結構域單體的protein disulfide isomerase(PDI)、多結構域單體的Middle East respiratory syndrome 27(MERS-27)及多結構域多種聚集狀態(tài)的bovine serum albumin(BSA)，其分子量、二級結構和高級結構特點等信息如表1(按分子量大小排序)所列.試驗結果發(fā)現(xiàn)，三種方法所測的5類蛋白的Tm值整體上較為一致，但也存在一定差異.而結構更復雜的蛋白，并不一定有更多個Tm值.

表1 蛋白質(zhì)樣品信息匯總

1 試驗部分

1.1 儀器

差示掃描量熱儀，馬爾文公司，型號為MicroCal Manual Vp-cap DSC(VP-DSC)；圓二色光譜儀，英國應用光物理(Applied Photophysics Ltd)，型號為Chirascan plus；差示掃描熒設備，Nanotemper公司，型號為Prometheus NT.48.

1.2 菌株與質(zhì)粒

SnRK2.6、PYL 10基因由清華大學顏寧實驗室惠贈，PDI基因由中國科學院生物物理所王志珍實驗室惠贈，MERS-27基因由王新泉實驗室惠贈，BSA購買自北京索萊寶科技有限公司，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞由本實驗室制備，HEK293F細胞由本實驗室培養(yǎng).

1.3 酶與生化試劑

質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物科技有限公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準marker為本實驗室制備；用于制備緩沖劑的Tris，NaCl，HEPES購自國藥集團化學試劑有限公司，純度均大于99%；Ni-NTA鎳柱柱材購自Qiagen公司；Sources Q、Superdex 200、protein A色譜柱購自Cytiva公司.

1.4 蛋白質(zhì)表達

將表達質(zhì)粒pet15D-PYL 10、pet15D-PYL 2、pet15D-PDI轉化至BL21感受態(tài)細胞，涂板過夜培養(yǎng)，挑菌點接種至100 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 37 ℃、220 r/min培養(yǎng)3～4 h, 以1∶100的比例將菌液轉接至1 L氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)3～4 h至OD600(即600 nm時的光密度值)約為0.8～1時降溫至18 ℃，平衡1 h后加入0.2 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達過夜，收菌體用于后續(xù)蛋白的純化.

MERS-27使用293F細胞表達，將輕鏈、重鏈質(zhì)粒、線性聚乙烯亞胺(PEI)按質(zhì)量比1∶1.2∶2混合于293培養(yǎng)基中孵育30 min，轉染生長期對數(shù)期的293F(按1 L細胞約加入1 mg質(zhì)粒比例加入)，培養(yǎng)約48 h離心收取上清純化抗體.

1.5 親和層析、離子交換層析與分子排阻層析

PYL 10、PYL 2、PDI使用Ni-NTA親和掛柱，250 mmol/L咪唑洗脫.抗體MERS-27使用protein A親和掛柱，1 mol/L pH為2.7甘氨酸洗脫后過分子篩.

PYL 10、PYL 2、PDI使用陰離子交換柱Sources Q進一步分離純化，使用緩沖液buffer A(250 mmol/L Tris pH為8.5)稀釋蛋白樣品約3倍體積后上Sources Q柱，以緩沖buffer B(250 mmol/L Tris pH為8.5, 1 mol/L NaCl)進行5%～50%體積比梯度洗脫，收取純度較高的部分進行濃縮過分子篩.

將Superdex 200層析柱用pH為7.2，10 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl緩沖液平衡，分別純化PYL 10、PYL 2、PDI、MERS-27、BSA(干粉溶解至1 mg/mL過柱)，收取純度較高部分測定其濃度.

1.6 Bradford法蛋白質(zhì)定量

取1 mL 1倍關系的考馬斯亮藍G-250稀釋液于1.5 mL離心管中, 根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的濃度加入1～20 μL蛋白質(zhì)溶液并混合均勻，使用分光光度計測量595 nm吸收值，根據(jù)事先制作標準曲線計算蛋白濃度，并將蛋白濃度調(diào)整至0.5～0.7 mg/mL用于后續(xù)Tm值測定.

1.7 三種Tm值測量方法參數(shù)設置與試驗操作

三種方法的變溫范圍均為20～95 ℃，變溫速率均為1 ℃/min.緩沖液條件均為10 mmol/L HEPES pH為7.2、150 mmol/L NaCl，樣品質(zhì)量濃度均在0.5～0.7 mg/mL.三種Tm測量方法的樣品用量與試驗時長信息如表2所列.

表2 三種測量方法的樣品用量與試驗時長比較

1.7.1 差示掃描量熱法

首先在樣品池中加入緩沖液重復4次變溫程序以獲得較準確的基線，再分別測定不同樣品獲得變溫曲線.

1.7.2 圓二色光譜法

單點變溫法：每個樣品先進行190～280 nm的波譜掃描，確定其CD信號最高或最低的波長(即變溫實驗中變化最顯著的波長)，在該波長下進行變溫掃描實時檢測(主要分布在210～220 nm).

多點變溫法：抗體樣品檢測中使用了多點變溫法，變溫掃描過程中檢測整個205～250 nm波段的變化.單點變溫數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)采用sigmoid或者double sigmoid模型擬合，選取最優(yōu)模型擬合結果，多點變溫數(shù)據(jù)使用global 3軟件分析.

1.7.3 差示掃描熒光法

利用毛細管吸取蛋白樣品約10 μL，5個蛋白樣品同時進行變溫掃描檢測.

2 結果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的表達與純化結果分析

蛋白PYL 2、PYL 10、PDI由原核表達系統(tǒng)表達，使用Ni-NTA親和純化，洗脫的蛋白經(jīng)陰離子交換柱Sources Q進一步純化.抗體MERS-27由293F細胞分泌表達，過protein A親和純化.5種蛋白最終經(jīng)分子篩Superdex 200純化后置換到相同的buffer條件中，純化結果dodecyl sulfate, sodium salt(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)如圖1所示.由圖1可見，分子量大小與預期一致，5種蛋白純度很高，均達到95%以上，調(diào)整其質(zhì)量濃度至0.5～0.7 mg/mL用于下一步測試分析.

圖1 蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.2 差示掃描量熱法測定結果

差示掃描量熱法測定5個蛋白質(zhì)的變溫掃描曲線如圖2所示.由圖2可見，5種蛋白的Tm值分布在40～80 ℃之間，其中PYL 2圖譜是尖銳的單峰，而PYL 10、PDI、BSA及MERS-27圖譜則呈現(xiàn)峰高與峰寬均有所差異的雙峰，反映了5種蛋白質(zhì)在升溫熱變性過程具有不同的解折疊特點.

圖2 DSC變溫掃描曲線

2.3 圓二色譜法對蛋白Tm值的測定結果

圓二色譜法測定5個蛋白的變溫掃描曲線如圖3所示.由圖3可見，PYL 2的變溫曲線在50 ℃左右時，斜率變化很大.PDI的曲線分別在30～60、60～70 ℃區(qū)間時，出現(xiàn)兩個不同曲線斜率.而PYL 10與BSA曲線斜率變化均沒有PYL 2大，MERS-27在65～75 ℃區(qū)間的曲線由下降陡變?yōu)樯仙笥窒陆?，推測是因為抗體受熱從而析出沉淀.而析出的沉淀則影響了CD光譜的檢測，因而出現(xiàn)信號異常.

圖3 CD變溫掃描曲線

2.4 差示掃描熒光法對蛋白Tm值的測定結果

使用差示掃描熒光法測定5種蛋白質(zhì)樣品，試驗得到的變溫掃描曲線如圖4所示.由圖4可見，對350/330 nm曲線(1)進行一階求導，可以得到對應的峰圖(2).一階導曲線可以直觀地反映受熱過程中蛋白結構的變化情況，峰尖或波谷對應蛋白的Tm值.

圖4 DSF變溫掃描曲線

2.5 三種方法測定蛋白Tm值的結果對比

差示掃描量熱法、圓二色譜法、差示掃描熒光法測定5種蛋白質(zhì)的Tm值的結果如表3所列.

表3 差示掃描量熱法、圓二色譜法、差示掃描熒光法對蛋白Tm值的測定結果統(tǒng)計及差異比較

使用三種測定方法對5種不同蛋白質(zhì)的Tm值進行測量，每種方法重復三次，選取其中一次變溫曲線展示在結果中(圖2～4).樣品用量及所用時長見1.6節(jié)，可以看出樣品用量：差示掃描量熱法>圓二色譜法>差示掃描熒光法，測定的總用時長：差示掃描量熱法>圓二色譜法>差示掃描熒光.此外，軟、硬件操作及后期數(shù)據(jù)處理的便捷性：差示掃描熒光>差示掃描量熱法>圓二色譜法.三種方法測量蛋白樣品的Tm值高低均為MERS-27>BSA>PYL 10>=PDI>PYL 2，反應的趨勢較為一致.

MERS-27的Tm值測定中，圓二色譜法曲線在65 ℃至75 ℃區(qū)間有信號異常[圖3(e)]，這是因為抗體受熱而沉淀析出影響了CD光譜的檢測.降低抗體濃度，采用多點變溫法測定獲得的數(shù)據(jù)表明抗體至少有一個確定的Tm值點71.5 ℃.在BSA的Tm值測定中，差示掃描量熱法圖譜顯示在78 ℃測得信號很低的峰，但圓二色譜法和差示掃描熒光法則沒有在該溫度點檢測到信號.

通過對三種檢測方法均檢測出的Tm值進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)三種檢測方法對PYL 10的Tm值檢測結果一致.圓二色譜法未測出MERS-27的Tm1，但測出的Tm2與其他兩種檢測方法結果一致.三種方法對PYL 2及PDI的檢測結果不一致，其中PYL 2的差示掃描量熱法與差示掃描熒光法檢測結果有一定的差異.PDI的三種檢測方法對其Tm1的檢測結果差異較為顯著.

3 結論

本文通過比較三種廣泛使用的蛋白質(zhì)Tm值測定方法分析5種不同特點的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，雖然檢測原理各不相同，但不同方法測定的Tm值結果總體一致或相近，除PDI的Tm1外，其余結果均相差2 ℃以內(nèi).同為光譜學方法的圓二色譜法和差示掃描熒光法檢測結果具有更高的一致性.需要指出的是在檢測抗體MERS-27時，檢測過程中觀察到絮狀沉淀析出，推測是該沉淀干擾CD信號檢測而不能確定Tm1，這說明MERS-27抗體的Tm值雖高，但是受熱不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生聚集.表明圓二色譜法不適合受熱易沉淀的蛋白質(zhì)的Tm值檢測，但是也可以利用這一特點作為抗體藥物等快速鑒定聚集產(chǎn)生的方法[16].

此外，圖譜中峰寬窄或曲線陡緩能夠在一定程度上反映結構受熱變化的快慢.例如，三種方法對PYL 2的Tm值測定中，尖銳的峰型(DSC、DSF)或是陡變的曲線(CD)都表明這是一個比較快的變化過程.

已知研究結果顯示，抗體類蛋白在熱變性時具有不同熱穩(wěn)定性的各結構域會先后去折疊，因而會檢測到多個Tm值[17-18].本文對比了蛋白Tm數(shù)量與蛋白結構域及聚集形態(tài)的關系，PYL 2和PYL 10具有單結構域，而PDI、BSA及MERS-27都具有多結構域，而PYL 10，PDI，MERS-27在溶液中都是以單體形式存在， BSA具有多種聚合狀態(tài)，PYL 2則以二聚體形式存在[11-15].本文研究結果表明，結構更復雜的蛋白，并不一定具有更多個Tm值.

比較三種方法實際操作的特點發(fā)現(xiàn)，DSF法在樣品用量及測定效率上更有優(yōu)勢，比較適合進行高通量篩選.但該方法需要樣品含有色氨酸、酪氨酸或額外添加熒光染料，這可能會對樣品測量范圍帶來一定限制.DSC法雖然在樣品用量與檢測效率上不及DSF，但作為量熱的經(jīng)典方法仍是不可缺少的Tm值測量手段，在進行批量樣品的熱穩(wěn)定性篩選時，聯(lián)合使用DSF法初篩，DSC法復篩是十分有效的組合方式.此外，DSC 能測定蛋白質(zhì)變性過程中的熱容變化ΔCp、焓變 ΔH、解折疊自由能ΔG、玻璃態(tài)轉變溫度、分子流動臨界溫度等其他重要熱力學參數(shù).CD作為檢測蛋白二級結構的經(jīng)典方法，在Tm值測定方面具有其獨特優(yōu)勢和一定的局限性，也是研究加熱過程中蛋白結構改變的重要方法[9].

蛋白質(zhì)Tm值測定具有重要的實際應用價值，例如輔助生物藥物開發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制，評估生物相似性、優(yōu)化蛋白藥物配方等，還可以作為探索蛋白質(zhì)高級結構的手段之一指導蛋白質(zhì)工程，如比較不同突變對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響[19-20]，研究結構域改變與功能活性改變關聯(lián)性等.比較不同Tm值測定方法，全面了解技術特點及測量效果對于Tm值測定的實際應用具有一定的指導意義，在科研或生產(chǎn)工作中可以靈活選用或聯(lián)用多種技術來闡明不同條件下的結構變化特點.