毋傳鏗 河南省焦作市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 454500

結(jié)核性腦膜炎屬于較嚴(yán)重的結(jié)核性疾病，是由于結(jié)核分枝桿菌感染腦部組織引起的非化膿性炎癥。該細(xì)菌屬于兼性細(xì)胞內(nèi)致病菌，能夠引起諸多無癥狀潛伏感染和進(jìn)行性疾病[1]。在其感染類型中，結(jié)核性腦膜炎是常見的肺外結(jié)核感染類型之一，但兒童感染致死率較高[2]。結(jié)核性腦膜炎在初次感染1年內(nèi)發(fā)病率最高，由于臨床癥狀不典型，缺乏特異性的診斷指標(biāo)，易被誤診為化膿性腦膜炎、病毒性腦炎及腦部腫瘤等。由于結(jié)核性腦膜炎病情發(fā)展迅速、早期不易明確診斷及預(yù)后不良等情況，亟需尋找快速準(zhǔn)確的診斷方法。近年來，分子生物學(xué)在臨床檢驗(yàn)上得到了廣泛應(yīng)用，熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)Ω鞣N病原學(xué)做出快速準(zhǔn)確診斷[3]。本文中采用熒光定量PCR檢測、抗酸染色涂片法及MTB培養(yǎng)法3種檢測方法進(jìn)行對比分析，探討熒光定量PCR檢測方法在結(jié)核性腦膜炎診斷中的意義。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月—2020年6月在我院就診的具有腦膜刺激征患者104例，其中男50例，女54例，年齡26～55歲，平均年齡(39.4±16.6)歲。根據(jù)是否確診對其進(jìn)行分組，其中非結(jié)核性腦膜炎組32例(病毒性腦膜炎13例、化膿性腦膜炎12例、腦部腫瘤7例)，確診結(jié)核性腦膜炎組48例，疑似結(jié)核性腦膜炎組24例。對三組患者進(jìn)行腰椎穿刺術(shù)留取腦脊液5ml，及時送檢。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 確診結(jié)核性腦膜炎標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)檢查，顯示大腦外側(cè)裂或基底池存在滲出物，腦回增強(qiáng)或腦積水；在腦膜炎病變基礎(chǔ)上，在腦脊液中檢測到結(jié)核分枝桿菌，或者在肺結(jié)核基礎(chǔ)疾病上，同時腦脊液檢測：蛋白定量升高，氯化物、葡萄糖水平降低；皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)顯示陽性。(2)惡性腫瘤、寄生蟲、細(xì)菌、真菌等細(xì)胞學(xué)檢查，均為陰性。(3)抗結(jié)核治療有效。疑似患者標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病時間>5d，神志改變，腦脊液檢查：血漿葡萄糖與腦脊液比值>0.5，以淋巴細(xì)胞為主；顱腦CT或MRI檢查異常，眼底檢查異常，合并有其他部位的結(jié)核。滿足以上4項(xiàng)為疑似患者。非結(jié)核性腦膜炎標(biāo)準(zhǔn)：腦膜炎類型已診斷明確，包括化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、腦部腫瘤及腦外傷等。

1.3 方法

1.3.1 住院儀器與試劑：抗酸染色劑由北京世濟(jì)合力生物科技有限公司生產(chǎn)，熒光定量PCR試劑由賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，儀器為ABI-PCR擴(kuò)增儀。

1.3.2 抗酸染色涂片法：留取2ml腦脊液，離心機(jī)以12 000r/min速度離心，時間為15min，留取沉渣進(jìn)行涂片，抗酸染色鏡檢，操作步驟遵照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》。

1.3.3 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法：采用液體培養(yǎng)法，細(xì)菌與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，利于結(jié)核分枝桿菌快速增長，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 按照試劑盒操作流程處理腦脊液：留取腦脊液500μl、進(jìn)行濃縮，取200μl濃縮液，震蕩混合均勻，離心機(jī)以12 000r/min離心速度離心，時間為3min，去除上清液；加入生理鹽水1ml，重懸沉淀，以12 000r/min離心速度再次離心，時間為3min，去除上清液，沉淀后備用。吸取50μl的核酸釋放劑，充分混合均勻。放置3～5min備用，吸取36μl PCR反應(yīng)液、內(nèi)標(biāo)液1μl、酶結(jié)合物2μl及制備好的樣本液5μl。設(shè)置溫度為94℃進(jìn)行預(yù)變性5min；然后設(shè)置溫度94℃持續(xù)15s，57℃持續(xù)30s，進(jìn)行40個循環(huán)；結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值>39的樣本，內(nèi)標(biāo)檢測為陽性，結(jié)果判定為陰性；Ct值≤39，曲線為標(biāo)準(zhǔn)的S形，結(jié)果判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，MTB DNA水平比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種檢驗(yàn)方法檢測MTB陽性率比較 確診結(jié)核性腦膜炎組的熒光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培養(yǎng)陽性率均高于疑似結(jié)核性腦膜炎組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，熒光定量PCR檢測陽性率高于抗酸染色涂片及MTB培養(yǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；熒光定量PCR靈敏性為70.83%(34/48),特異性為70.83%(17/24)；抗酸染色涂片靈敏性為8.33%(4/48)，特異性為95.83%(23/24)；MTB培養(yǎng)靈敏性為16.67%(8/48)；特異性為87.50%(21/24)；熒光定量PCR與抗酸染色涂片法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法比較，具有更高的靈敏性(P<0.05)。32例非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液不同檢測方法檢測均為陰性。見表1。

表1 3種檢驗(yàn)方法檢測MTB陽性率比較

2.2 結(jié)核分枝桿菌DNA檢測 確診結(jié)核性腦膜炎組患者M(jìn)TB DNA對數(shù)值為4.627±0.816，疑似結(jié)核性腦膜炎組患者M(jìn)TB DNA對數(shù)值為4.354±0.928，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

3 討論

結(jié)核性腦膜炎是結(jié)核分枝桿菌感染引起的非化膿性炎癥，可導(dǎo)致腦膜、腦實(shí)質(zhì)及腦血管等組織損傷[4]。結(jié)核性腦膜炎是最為常見的肺外結(jié)核類型之一，約占1%。該疾病發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率高達(dá)30%左右，尤其是兒童患者[5]。因此，早期診斷、早期干預(yù)是治療的關(guān)鍵。結(jié)核性腦膜炎癥狀繁多，腦脊液實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏典型變化特征，病原學(xué)檢測和生化檢查敏感度和特異性低，在發(fā)病早期，影響疾病的診斷[6]。因此，尋找新的檢測方法以提高檢測的特異性和敏感性十分必要。

目前，細(xì)菌學(xué)檢測仍是結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室檢測主要包括抗酸染色涂片及MTB培養(yǎng)法?？顾崛旧科奶攸c(diǎn)為快速、費(fèi)用低廉、易操作，但是其特異性、敏感度均較低[1]。目前，MTB培養(yǎng)法為結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，該檢測方法特異性高，但是培養(yǎng)時間較長，需4～6周才能得到檢測結(jié)果，并且僅有活菌才有可能培養(yǎng)成活，往往影響結(jié)核的早期診斷[7]。熒光定量PCR技術(shù)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，其敏感度、特異度均較高，對病原體的檢測非常簡便。高麗等[8]學(xué)者研究顯示結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)具有更高的敏感度和特異性，但是研究提到該技術(shù)要求較高，并且檢測費(fèi)用昂貴，尚處于推廣階段。結(jié)核分枝桿菌PCR在診斷方面的優(yōu)勢仍無法被取代。

本文中，確診結(jié)核性腦膜炎組的熒光定量PCR、抗酸染色涂片及MTB培養(yǎng)陽性率高于疑似結(jié)核性腦膜炎組(P<0.05)，熒光定量PCR檢測陽性率高于抗酸染色涂片及MTB培養(yǎng)陽性率，且具有更高的靈敏性(P<0.05)。32例非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液不同檢測方法檢測均為陰性。確診結(jié)核性腦膜炎組與疑似結(jié)核性腦膜炎組在結(jié)核分枝桿菌DNA水平方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明熒光定量PCR對疑似和確診結(jié)核性腦膜炎檢測水平是一致的。本研究結(jié)果陽性率與劉喆等[9]學(xué)者報(bào)道的53%～82%相一致，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗酸染色涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)方法。但是仍然存在29.17%的假陰性患者，分析原因，可能與以下因素相關(guān)：(1)部分結(jié)核性腦膜炎患者已經(jīng)在他院經(jīng)過抗結(jié)核治療，入院后檢測可能影響陽性檢出率。(2)結(jié)核分枝桿菌DNA拷貝數(shù)偏低。在炎癥早期，未達(dá)到檢測試劑下限。結(jié)核分枝桿菌DNA拷貝量的檢測下限為4.14×103，腦脊液MTB DNA拷貝數(shù)為低于檢測下限，表明疾病處于早期階段，或者由于血腦屏障的作用，影響熒光定量PCR的檢測結(jié)果。因此，對于疑似結(jié)核性腦膜炎患者應(yīng)及時復(fù)查MTB DNA，以明確診斷，提高結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性率[10]。

熒光定量PCR檢測雖然不能替代傳統(tǒng)檢測方法，但是該檢測技術(shù)較為成熟，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，且敏感性和特異性均較高。對于結(jié)核性腦膜炎的早期診斷，尤其是對一些傳統(tǒng)檢測方法及臨床癥狀不典型的病例，其檢測結(jié)果具有重要的參考價值。因此，對于存在有結(jié)核性腦膜炎臨床癥狀的患者，應(yīng)當(dāng)早期連續(xù)進(jìn)行熒光定量PCR檢測。