易凡

摘要：現(xiàn)代發(fā)酵工藝包括補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、固體發(fā)酵等多種發(fā)酵方式，而本文將會集中這三種進行原理和案例上的討論。補料分批發(fā)酵源于封閉培養(yǎng)、調整碳源ph值等因素的分批發(fā)酵，在其基礎上增加了以控制方式向細胞培養(yǎng)物喂養(yǎng)碳源的過程。此種發(fā)酵方式應用相較其他兩種比較普遍。連續(xù)發(fā)酵也是一個封閉的發(fā)酵系統(tǒng)，這種發(fā)酵系統(tǒng)可以無限制運行——通過連續(xù)或者間歇地添加新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基至發(fā)酵罐中，但容易收到雜菌污染和代謝不便。固體發(fā)酵是指微生物在沒有自由液體存在的情況下在固體材料上生長的發(fā)酵過程。這種方式擁有介質便宜等優(yōu)點，但也受限于難以調整參數(shù)和檢測生物量。

關鍵詞：補料分批發(fā)酵;連續(xù)發(fā)酵;固體發(fā)酵;發(fā)酵工藝

一、背景

發(fā)酵（fermentation）由拉丁語詞根“翻涌”（fervere）展開來，起初指代果實發(fā)酵期間翻騰冒泡的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象是由沉浸在液中的糖分被降解時產生的二氧化碳排放所引起的。微生物生理學中的發(fā)酵屬于一種無氧環(huán)境下的生物氧化方式，可以使用來制備微生物本身、直接與次級代謝產物。能夠進行發(fā)酵作用的微生物包括酵母菌、枯草芽孢桿菌等。發(fā)酵主要分為乳酸發(fā)酵以及酒精發(fā)酵。在乳酸發(fā)酵過程中， 發(fā)酵與有氧呼吸的起始步驟相同，都為糖酵解，并同樣在過程中產生兩個ATP集團和NADH集團。然而，不同于進行有氧呼吸，在發(fā)酵過程中產生的丙酮酸不會通過氧化以及檸檬酸循環(huán)，也因此不會通過電子傳輸鏈，導致在糖酵解中產生的NADH無法通過此通路去掉一個氫原子形成NAD+。因此，在糖酵解過后產生的兩分子三碳的丙酮酸被NADH給予氫原子形成乳酸和NAD+。而在酒精發(fā)酵中，一個羧基從丙酮酸中被移除，并以二氧化碳的形式釋放出來，產生一個叫作乙醛的雙碳分子。然后NADH的電子被釋放到乙醛，再產生出NAD+，并形成乙醇。乳酸發(fā)酵產生的代謝產物被應用于奶制品，如奶酪、酸奶等制作行業(yè)中，而酒精發(fā)酵所產生的乙醇則是制酒必不可少的原料，甚至中式香腸制作過程中也包含發(fā)酵。

現(xiàn)代發(fā)酵工程則是一種利用生物細胞的特性，通過現(xiàn)代化工程手段進行工業(yè)化規(guī)模應用發(fā)酵原理的技術。早在人們對于微生物這一概念具有認知時，發(fā)酵就已經被廣泛應用于世界上的食品釀造工程。西方的啤酒、葡萄酒、面包、奶酪，中東地區(qū)的乳酸發(fā)酵產物，以及東方的醬、醬油都是人類對食材進行天然發(fā)酵之后獲得的產物。發(fā)酵工藝的工業(yè)化極大得益于第二次世界大戰(zhàn)中對于丙酮與青霉素等戰(zhàn)時資源的剛性需求;當時的青霉素和丙酮采用的培養(yǎng)法經常面臨產量無法滿足軍隊需求以及易受雜菌感染的問題，而當時來自加拿大、美國等國的科研人員則通過采用加壓蒸汽滅菌技術、無菌接種技術， 配以帶有攪拌和通風裝置的圓柱形鋼性發(fā)酵罐來解決雜菌污染問題。同時，為了更穩(wěn)固的產量控制，科研人員制定和完善了發(fā)酵過程中的發(fā)酵液、pH、溫度、營養(yǎng)物質等指數(shù)。這一系列改革是發(fā)酵工業(yè)史上最為重大的變革之一，并奠定了現(xiàn)代發(fā)酵工藝的技術基礎。隨后，在20世紀60年代初，幾家跨國公司決定投資生產微生物生物質作為飼料蛋白的來源。然而，由于微生物生物質的銷售價格相對較低，為了使該過程能夠順利進行，其生產量必須比其他發(fā)酵產品大得多。此外，碳氫化合物被認為是潛在的碳源，將導致這些發(fā)酵對氧氣的需求增加和高熱量輸出。這些要求導致了壓力噴射器和壓力循環(huán)發(fā)酵器的發(fā)展，并且由于連續(xù)操作的工藝需求，向容器中添加新鮮培養(yǎng)基和去除培養(yǎng)液來持續(xù)培養(yǎng)生物體的技術也被幾家公司試驗。其中最成功的是ICI Pruteen動物飼料工藝，它利用一個連續(xù)的300萬立方米的壓力循環(huán)發(fā)酵罐，以甲醇為碳源培養(yǎng)嗜甲烷菌（Smith，1981;Sharp，1989）。如今，借助DNA理論以及合成生物學的發(fā)展，相關人員可以通過對微生物完整基因組的測序、比較和定向選擇來篩選出更為優(yōu)秀的菌株。在2006， Masato Ikeda、Junko Oh等科研人員針對增加谷氨酸棒狀菌菌株對于L-賴氨酸的生產效率進行了研究;他們在hom，lysC，dapE，dapF，thrB，和thrC這六個基因位點通過配子替代主導了突變，使原本不生產L-賴氨酸的谷氨酸棒狀菌菌株能夠產出100克/升的L-賴氨酸。

發(fā)酵工藝需要在培養(yǎng)接種物的過程中和在生產發(fā)酵罐中用于培養(yǎng)加工生物體的培養(yǎng)基配方，對于培養(yǎng)基、發(fā)酵罐和輔助設備的消毒，以及足夠數(shù)量的活性純培養(yǎng)物，以接種到生產容器中。本文主要討論補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和固體發(fā)酵三種發(fā)酵工藝，講述它們的基本原理和各個工藝的實踐成果。

二、區(qū)分發(fā)酵系統(tǒng)的特征

基于產量的最大化，不同的發(fā)酵策略被實踐。目前比較普遍的是補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、固體發(fā)酵等。本文會將以上三種發(fā)酵系統(tǒng)納入討論。

（一）分批發(fā)酵

批量發(fā)酵（Batch fermentation）是一個封閉的培養(yǎng)系統(tǒng)，因為僅有有限的滅菌營養(yǎng)介質被引入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基被接種上合適的微生物，并培養(yǎng)一定的時間，使發(fā)酵在最佳生理條件下進行。在發(fā)酵過程中加入空氣形式的氧氣、消泡劑和酸或堿，以控制pH值。在培養(yǎng)過程中，微生物的細胞會進行繁殖，并經歷不同的生長和代謝階段，因此，培養(yǎng)基的成分、生物量和代謝物都會發(fā)生變化。發(fā)酵要進行一定的時間或直到營養(yǎng)物質耗盡。培養(yǎng)液被收割，產品被分離。批量發(fā)酵可用于生產生物質、初級代謝物和次級代謝物。而在此基礎上發(fā)展出的補料分批發(fā)酵（fed batch fermentation）則增加了以控制方式向細胞培養(yǎng)物喂養(yǎng)碳源的過程。相比固定的批量發(fā)酵，補料分批發(fā)酵可以對培養(yǎng)物的底料進行限制，因此可以避免產生通常與過量的殘留葡萄糖有關的副產品。喂養(yǎng)批處理方法可以分為兩種不同的策略：固定體積喂養(yǎng)批次，以及可變體積的喂養(yǎng)批次。在固定體積方案中，碳源的喂養(yǎng)不需要對培養(yǎng)物進行稀釋。這可以通過在高濃度下喂養(yǎng)限制性底物來實現(xiàn)，以抵消任何稀釋的影響，或者通過直接將底物透析到培養(yǎng)基中。

最常被使用補料分批發(fā)酵來增加產量的菌株為大腸桿菌 （E.coli）。Narender Kumar，Sarabjeet Kour Sudan等學者在2019年使用補料分批發(fā)酵法培養(yǎng)帶有一種新型鹵代內切葡聚糖酶Cel5R的大腸桿菌BL21菌株。初始培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分包括：（a）KH2PO4，12.42克/升;（NH4）HPO4，5.71克/升;微量金屬包括檸檬酸，6.35克/升;EDTA，0.34克/升;氯化鈷，0.1克/升;氯化錳，0.6克/升;硫酸銅，0.08克/升;硼酸，0.12克/升;鉬酸鈉，0.1克/升;硫酸鋅，.68克/升;氯化鐵，4克/升（b）葡萄糖，9.52克/升（c）硫酸鎂，5.71克/升，而用于喂養(yǎng)批次發(fā)酵的培養(yǎng)基包含（a）葡萄糖，464克/升（b）MgSO4，22克/升。酵母提取物和胰蛋白酶在初始培養(yǎng)基中分別加入2.8g/l和11.24g/l。前期飼料中的濃度分別為61.42 g/l和247.14 g/l。在后期培養(yǎng)基中加入133.33克/升酵母提取物和400克/升胰蛋白酶。在他們實驗下，內切葡聚糖酶的生產顯示出從搖瓶發(fā)酵到喂養(yǎng)批次發(fā)酵的40倍增長，蛋白質的產量也從500微克/升增加到3克/升，是至今重組內切葡聚糖酶的最高產量報道。同樣在2019年，Anna-Lena Altenhoff，Sven Thierbach等學者同樣使用補料分批發(fā)酵策略來培養(yǎng)帶有乳膠清除蛋白VH2（latex clearing protein）的大腸桿菌K30菌株，使用PET23a質粒獲得了60克/升的細胞干重和223毫克/升的可溶性活性Lcp1VH2的產量，達到了使用同樣菌株但使用復雜的自動誘導培養(yǎng)基的發(fā)酵過程相比提高了將近十倍的產量。

對于補料分批培養(yǎng)的建模也已經有人嘗試。在2021年6月，一個基于構建動態(tài)隔間模型來模擬補料分批的發(fā)酵過程被構建出來。該模擬允許對所有的過程變量（如葡萄糖和溶解氧濃度）進行時空表征，以及對細胞隨時間變化所經歷的代謝制度進行量化分析。此模型使用S.cerevisiae 為參考，應用了30個 參數(shù)以上（詳見附件1）。通過四個階段：

以CFD為基礎的不同體積的自動分室設計

構建不同體積的隔層地圖庫

對喂養(yǎng)策略在原體積上導致的增長做測量

分別計算每個分區(qū)中總傳質系數(shù)和飽和狀態(tài)下的氧氣濃度

研究者成功解決了動態(tài)模型的建立（公式與模型詳見附件2）。

（二）連續(xù)發(fā)酵

連續(xù)發(fā)酵也應用一個封閉的發(fā)酵系統(tǒng)。這種發(fā)酵系統(tǒng)可以無限制運行——通過連續(xù)或者間歇地添加新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基至發(fā)酵罐中。在添加新培養(yǎng)基時，系統(tǒng)也在不斷抽取等量的帶有微生物的舊培養(yǎng)基，進行回收細胞和發(fā)酵產物處理。這種發(fā)酵系統(tǒng)理論上體積和營養(yǎng)物質的濃度都保持在最佳水平，并減少了停機時間和降低了操作成本。

1981年，Hughes和Richardson申請了一個發(fā)酵過程的專利，從他們在試驗如何使用Alcaligenes sp.菌株在一個發(fā)酵器中連續(xù)生產PHB。他們通過不斷提供含有營養(yǎng)鹽、碳和能量源以及被微生物同化的水溶性化合物的培養(yǎng)基實現(xiàn)了對于Alcaligenes sp菌株的連續(xù)發(fā)酵。同時，他們設計的發(fā)酵系統(tǒng)也可以從培養(yǎng)基中除去等量的含有細菌細胞的培養(yǎng)基，從而使容器中的水介質量保持恒定。此專利很快通過，并與1984年公開。Hughes和Richardson的發(fā)明可以看作是連續(xù)發(fā)酵的創(chuàng)始。

近年來，連續(xù)發(fā)酵的使用愈加廣泛。這是得益于連續(xù)發(fā)酵在不少生產應用上的呈現(xiàn)出了不錯的產量。例如，英國ICI公司采用連續(xù)培養(yǎng)的方法生產單細胞蛋白，使用體積為1500立方米的巨型發(fā)酵罐，使年產量達到7萬噸。同時，Wen-Chien等人在一個雙罐系統(tǒng)中用連續(xù)發(fā)酵成功地提高了乙醇產量。在他們的研究中，連續(xù)發(fā)酵的進料糖濃度為160克/升，r=0.9，稀釋率為0.2/h，取得了最高的生產率，產品蒸汽中未轉化的糖小于2%。在相同的細胞回收率下，進料濃度為80-200克/升時，可以達到6.9-7.5克/升的生產率范圍。而在相同底料條件下，分批發(fā)酵導致的生產率為3.85-4.48克/升 。除此之外，連續(xù)發(fā)酵也被考慮為促進丁醇生產的方案之一。2021年，來自尼日利亞和英國的科研人員Chinedu Casmir Etteh，Abdulrazap Olalekan等人就使用連續(xù)發(fā)酵增進生物丁醇產量在期刊《科學非洲人（Scientific African）》上刊登了一篇文章。人員從對豐富和可負擔的可再生資源的燃料的需求入手，4.9克/升葡萄糖，55克/升木糖，8.7克/升果糖，7.7克/升甲酸，和0.001克/升阿魏酸為底料，通過丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol）連續(xù)發(fā)酵生物丁醇。他們將切碎的手巾（10克）稱量到250毫升的螺旋蓋瓶中，然后加入150毫升的TYA，在120℃下高壓滅菌15分鐘。準備了一個對照基質，以監(jiān)測和比較本實驗中使用的梭菌菌株的生長和溶劑生產情況。結論中，他們用C.saccharoperbutylacetonicum NCIMB 12，606 （N1-4）的木材水解物發(fā)酵液產生的丁醇濃度為（2.49g/L），占溶劑濃度的88.3%。補充兩倍稀釋的鍋巴酒，產生的總溶劑濃度為3.66克/升，其中丁醇占84.1%以上。當使用兩倍濃縮的胰島素-酵母提取物-醋酸酯培養(yǎng)基（TYA）時，丙酮-丁醇-乙醇溶劑產量最高，總溶劑濃度為9.37克/升，丁醇占65.5%。用實驗室用過的手巾（LHT）同時進行糖化和發(fā)酵，使C.saccharoperbutylacetonicum的總溶劑濃度達到了4.78g/L（詳細的菌株效率對照表可見于附件4）。在農業(yè)上連續(xù)發(fā)酵也有應用;以武國慶帶領的科研團隊使用脫殼稻谷為原料，在實驗室構建了一個由1個進料罐，2個酒母擴培罐，3個連續(xù)發(fā)酵罐和2個間歇罐組成的半連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)（具體圖示見附件3），最后使全糙米發(fā)酵成熟醪平均酒份達15.36%/vol。

然而，連續(xù)發(fā)酵也并非沒有缺點。通常，人們認為連續(xù)發(fā)酵一個比較大的問題在于雜菌污染的可能性，以及菌株遺傳沒法很好的得到控制。同時，連續(xù)發(fā)酵在過去二十年工業(yè)上并不常用于生產大量微生物代謝產物，并且在一些條件下優(yōu)勢并不明顯。因此，可以得出相較補料分批發(fā)酵來說，連續(xù)發(fā)酵有一定優(yōu)勢，但也存在一些局限性。

（三）固體發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵（Solid-state fermentation）被定義為微生物在沒有自由液體存在的情況下在固體材料上生長的發(fā)酵過程 。這項技術獲得關注是因為微生物，特別是真菌培養(yǎng)物，在與自然環(huán)境相似而不是純粹發(fā)酵罐的發(fā)酵條件下能夠產生相當高滴度的代謝物 。盡管固態(tài)發(fā)酵并不處于液體環(huán)境中，水分的存在仍然至關重要。水活度（Aw）這個在指代水溶液的蒸氣壓與相同溫度下純水的蒸氣壓之比，并于1953年被Scott引入微生物學。在固體狀態(tài)下，基質內的低濕度限制了微生物的生長和代謝。因此，Aw對于微生物的活性有很大影響，并且對于這個參數(shù)的控制可以用來改變微生物的代謝生產和排泄。此外，較高的水活度也提高了底物向真菌生物量的轉化率，因為水活度的降低導致質量傳遞的降低。

除去Aw之外，pH、溫度和底物結構對于固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)也至關重要。與Aw相同，這些參數(shù)因菌株和底物不同而有變化，如真菌類嗜好算酸性環(huán)境和低濕度（35%-70%的水分），而細菌類則嗜好更為穩(wěn)定的pH環(huán)境，更充分的水分（70%-90%的水分）以及更恒定的溫度（25攝氏度-30攝氏度）。生物體旺盛的代謝活動通常會產生熱量，這些熱量也通常由于固體層中的熱傳導相對較差停留在基質顆粒中。

（固體發(fā)酵系統(tǒng)的圖示可見附件4）

相較其他液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵有許多優(yōu)點：

介質很便宜?？梢允褂霉任?、麥麩和其他農產品。

固態(tài)發(fā)酵的凈化、回收和處理下游過程通常比液體發(fā)酵簡單。

固態(tài)發(fā)酵沒有廢水排放。

2021年Arunchand Rayaroth，Rajesh Singh Tomar等人便使用固體發(fā)酵對乙醇進行了大規(guī)模生產。

然而，固態(tài)發(fā)酵的問題也同樣存在。使用固態(tài)基質的一條主要后果便是難以調控發(fā)酵參數(shù)。以pH值為例，它影響發(fā)酵過程中的微生物的生長，從而影響纖維素酶的生產，但在固體基質中卻很難測量和調整它。這種問題也同樣出現(xiàn)在系統(tǒng)的溫度上。雖然有幾種間接的生物量測量方法，如總蛋白估計、真菌細胞壁成分測量（正乙酰葡萄糖胺）等，以及直接的方法，如二氧化碳蒸發(fā)量和氧氣攝入量，但在SSF中，生物量的測量是困難的、煩瑣的，使基于其的建模及其困難。因此，盡管固態(tài)發(fā)酵在培養(yǎng)基成分和發(fā)酵環(huán)境中具有創(chuàng)新性，它的效率與問題使此種發(fā)酵方式的使用相對受限。

三、結語

除去以上幾種典型方式，還存在沉浸式發(fā)酵、無菌發(fā)酵等等不同的工業(yè)發(fā)酵方式?？茖W界以及商業(yè)界都在不斷根據(jù)自身以及社會的需求不斷開發(fā)、調整不同的發(fā)酵工藝。在不遠的將來，發(fā)酵工藝的發(fā)展會不斷沖擊效率、產量新高。

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