張力，梅偉，王培民

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，南京 210029)

疼痛是臨床常見癥狀和亟待解決的難題，為十大致殘病因之一[1]。近年研究致力于探索外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)對傷害性刺激的感知和反應(yīng)，以期闡釋疼痛的發(fā)生及痛覺敏感的維持。關(guān)于膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的研究顯示，機械敏感離子通道瞬時受體電位香草酸亞型4、冷刺激敏感離子通道瞬時受體電位通道A1、瞬時受體電位melastatin 8具有介導(dǎo)機械痛敏、冷痛敏的重要作用，并提出“以痛為樞、截斷扭轉(zhuǎn)”控制膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療理念[2-4]。近年研究表明，疼痛是涉及感覺識別、情感激勵和認(rèn)知維度的綜合體驗[5]，因此疼痛研究不僅需要關(guān)注痛覺的感知和傳導(dǎo)，還需強調(diào)痛覺敏化的形成。此外，光遺傳學(xué)技術(shù)利用遺傳學(xué)方法使光敏感通道蛋白在參與疼痛感知的特定離子通道、細(xì)胞或組織中穩(wěn)定表達，實現(xiàn)了光照控制下的疼痛信息處理，并使自由行為動物感覺傳入、脊髓神經(jīng)元活動、皮質(zhì)加工處理疼痛信息等的操作迅速進展，且廣泛運用于疼痛及其敏化特征的研究?，F(xiàn)就光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于疼痛領(lǐng)域的研究進展予以綜述，以期推動光遺傳學(xué)技術(shù)在疼痛研究中的應(yīng)用，并促進疼痛機制的研究以及鎮(zhèn)痛治療的進步。

1 疼痛與痛覺敏化

1.1疼痛的感知與傳導(dǎo) 疼痛的感知始于感覺神經(jīng)纖維中表達的外周傷害感受器對傷害性刺激的處理，隨后疼痛信號傳遞至初級感覺傳入的外周終端——背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)。疼痛信息在DRG完成整合處理后傳遞至脊髓背角，隨后到達脊髓上節(jié)段(包括腦干、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)及皮質(zhì))并產(chǎn)生疼痛感覺[6]。值得注意的是，脊髓及脊髓上節(jié)段均可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛信號進行抑制性處理，疼痛感知可理解為一種疼痛傳遞/抑制傳遞的失衡，這可能是中樞敏化形成以及導(dǎo)致不同個體對疼痛耐受差異的原因。因此，完整的疼痛體驗是感覺識別、情感激勵和認(rèn)知維度的綜合評價[7]，見圖1。

DRG：背根神經(jīng)節(jié)

位于DRG的痛覺傷害性感受器種類多元、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。DRG屬于假單極神經(jīng)元，中樞突和外周突合并成“T”型結(jié)構(gòu)連接細(xì)胞體，外周突分布于體表、骨、骨骼肌，感知傷害性刺激，中樞突終止于脊髓背角Ⅰ層邊緣和Ⅱ?qū)幽z質(zhì)區(qū)[8]。常根據(jù)髓鞘特性、感受刺激類型、電壓門控通道的不同對痛覺感受器進行分類，如機械敏感離子通道瞬時受體電位香草酸亞型4、冷刺激敏感離子通道瞬時受體電位通道A1、瞬時受體電位melastatin 8；此外，參與炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的傷害性感受器也不同[9]。

1.2痛覺敏化的形成 病理狀態(tài)下各個脊髓節(jié)段疼痛信號的傳導(dǎo)均與正常狀態(tài)不同，相應(yīng)的病理改變形成了痛覺敏化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，傷害局部和DRG參與外周敏化，而脊髓及脊髓上節(jié)段則參與了中樞敏化[10]。

局部炎癥或損傷引起炎癥介質(zhì)釋放，痛覺感受器的閾值降低，進而使DRG神經(jīng)元興奮、放電頻率增加，甚至產(chǎn)生異常放電，形成外周敏化。因此，外周敏化主要涉及炎癥環(huán)境的維持、離子通道的敏化以及疼痛相關(guān)受體的活化[11]。經(jīng)典的促炎因子白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-18、腫瘤壞死因子-α等不僅參與了局部組織的炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，還參與了外周敏化的形成[12]；電壓門控鉀通道家族、電壓門控鈉通道家族、質(zhì)子門控離子通道、瞬時受體電位通道等離子通道的異?；罨ㄟ^異常的生物電傳導(dǎo)參與外周敏化[13]；此外，DRG膜表面G蛋白偶聯(lián)受體、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體等疼痛相關(guān)受體也通過釋放神經(jīng)肽(P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽)改變細(xì)胞內(nèi)能量代謝、調(diào)節(jié)磷酸化水平等，從而影響外周敏化[14]。

脊髓節(jié)段的中樞敏化較外周敏化更復(fù)雜，既受外周傳入的影響，又受脊髓上節(jié)段的調(diào)節(jié)，同時脊髓背角神經(jīng)元自身的改變也是脊髓節(jié)段中樞敏化的重要因素。外周敏化引起的DRG過度放電引起脊髓節(jié)段免疫細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)的活化，從而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，隨后出現(xiàn)與外周敏化相似的致敏過程[15]。中樞節(jié)段的神經(jīng)炎癥直接作用于神經(jīng)元軸突、突觸周圍，更易于造成局部的神經(jīng)損傷[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，軸突損傷后的芽生是中樞敏化的重要成因，如DRG的軸突芽生形成“籃狀”結(jié)構(gòu)包繞DRG神經(jīng)元胞體、DRG軸突芽生異位侵入脊髓背角Ⅲ、Ⅳ層，這些均與脊髓節(jié)段的中樞敏化高度相關(guān)[17]。脊髓節(jié)段的下行傳入主要起于中縫大核的5-羥色胺能神經(jīng)元，起自藍斑核、腦橋的去甲腎上腺素能神經(jīng)元和來自延髓的γ-氨基丁酸能神經(jīng)元。在正常生理狀態(tài)下，去甲腎上腺素能軸突釋放的去甲腎上腺素通過刺激α2腎上腺素能受體在脊髓背角產(chǎn)生抑制神經(jīng)元興奮的作用，而外周敏化則減弱了這些下行傳入的疼痛抑制作用，使脊髓背角神經(jīng)元的興奮性相對增加，推動中樞敏化[18]。此外，脊髓背角神經(jīng)元分為中間神經(jīng)元和投射神經(jīng)元，中間神經(jīng)元的興奮性異常或投射神經(jīng)元的突出可塑性改變均能在脊髓節(jié)段對中樞敏化進行調(diào)節(jié)[19]。

脊髓上節(jié)段的中樞敏化是參與疼痛感知、調(diào)控多個腦結(jié)構(gòu)域共同作用的結(jié)果，是多個神經(jīng)環(huán)路易化和抑制的綜合結(jié)果。神經(jīng)影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了傷害性刺激激活的腦區(qū)域，包括初級軀體感覺皮質(zhì)、次級軀體感覺皮質(zhì)、前扣帶回皮質(zhì)(anterior cingulate cortex，ACC)、前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex，PFC)、島葉、杏仁核、丘腦、小腦以及中腦區(qū)——腹側(cè)被蓋區(qū)和伏隔核[20]，上述區(qū)域的功能在傷害感覺的背景下存在聯(lián)系，在執(zhí)行對疼痛信號的感知調(diào)控過程中產(chǎn)生痛苦體驗，還可影響多種神經(jīng)功能(認(rèn)知、情感、動機等)，部分解釋了抑郁、焦慮、帕金森病、阿爾茨海默病等對中樞敏化的影響[21]。目前，人們對這些神經(jīng)通路的具體效應(yīng)途徑的認(rèn)識仍有限，因此尋找一種能夠觀察研究特定神經(jīng)元類型、獨立神經(jīng)通路的技術(shù)至關(guān)重要。

2 光遺傳學(xué)

光遺傳學(xué)利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)光敏離子通道(opsin)的特異表達，以控制細(xì)胞中的信號事件，滿足疼痛領(lǐng)域研究中高時間、高空間精度調(diào)控神經(jīng)元活性的要求。Oesterhelt和Stoeckenius[22]于1971年發(fā)現(xiàn)了第一個光敏離子通道——細(xì)菌視紫紅質(zhì)(一種綠光驅(qū)動的質(zhì)子泵)。1977年，Matsuno-Yagi和Mukohata[23]發(fā)現(xiàn)了一種抑制性氯通道——嗜鹽菌紫紅質(zhì)(一種黃光驅(qū)動的氯離子通道)。藍光驅(qū)動的單價陽離子——視紫紅質(zhì)通道(channelrhodopsin，ChR)[24]的發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)了動物體內(nèi)精確敏感的光刺激對神經(jīng)元細(xì)胞膜離子通道的開啟或關(guān)閉，并實現(xiàn)了對激活特定神經(jīng)元后動物行為的直接觀察[25]。ChR突變體(如ChR2-H134R和ChR2-T159C)的位點突變旨在增加靈敏度和光電流[26]。研究者基于ChR晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計出介導(dǎo)氯離子的抑制性ChR，進而開發(fā)了雙穩(wěn)態(tài)變體抑制性ChR，該通道允許短暫的藍光激活和隨后的紅光失活[27]。上述光敏離子通道的驅(qū)動光源和離子類型見表1。除光敏離子通道外，嵌合光敏感的G蛋白偶聯(lián)受體、光學(xué)激活的μ阿片受體、嵌合視紫紅質(zhì)/β2腎上腺素能受體均被開發(fā)應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)信號通路的研究[28]。

表1 光敏離子通道

遺傳學(xué)技術(shù)針對選定細(xì)胞的特異性啟動子調(diào)控光敏離子通道基因在實驗動物中的轉(zhuǎn)錄。在疼痛領(lǐng)域的研究中，近85%傷害感受器表達電壓門控鈉通道NaV1.8，因此，針對NaV1.8啟動子選擇性地在傷害感受器中表達光敏離子通道有助于對該離子通道的觀察[29]；表達Mas基因相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體D的神經(jīng)元能夠感受機械性傷害刺激，靶向該受體啟動子實現(xiàn)光敏離子通道的表達，有助于機械痛覺敏感的研究[30]。Sanders等[31]成功在Fos陽性神經(jīng)元中表達光敏離子通道，實現(xiàn)僅對特定事件中受刺激活化神經(jīng)元的觀察。此外，非神經(jīng)元細(xì)胞也可以是光遺傳學(xué)的研究靶標(biāo)，如靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子的研究，有助于理解神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛狀態(tài)中的相互作用[32]。

除在光敏離子通道蛋白開發(fā)和使用方面的進展外，光遺傳學(xué)技術(shù)(圖2)在基因傳遞、光的使用等方面也取得了進步。血腦屏障的存在，使蛋白質(zhì)向大腦的輸送十分困難，而以慢病毒或腺病毒為載體遞送光敏離子通道蛋白則很好地解決了上述問題。腺病毒具有非致病性、非免疫原性、不裂解細(xì)胞等優(yōu)點，且轉(zhuǎn)染高效穩(wěn)定。近年來，關(guān)于腺病毒載體(腺病毒衣殼蛋白、腺病毒血清)等方面的研究取得了一定的進展，顯著提高了其轉(zhuǎn)染效率[33]。有研究嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因動物特定細(xì)胞表達光敏離子通道，但該方法受到啟動子活性的限制，難以實現(xiàn)細(xì)胞特異性[34]。此外，光源的使用也一直是光遺傳學(xué)技術(shù)的挑戰(zhàn)之一，通過光纖接口與LED或激光二極管系統(tǒng)耦合的輕量柔性光纖將光傳輸?shù)礁畹哪X組織，可同時刺激和記錄實驗動物的特定神經(jīng)元活動[35]。而閉環(huán)電路和電流儀的使用實現(xiàn)了無線光刺激和實時控制，更能模擬自然環(huán)境[36]。

圖2 光遺傳技術(shù)示意圖

3 光遺傳學(xué)在疼痛領(lǐng)域的應(yīng)用

利用光遺傳學(xué)技術(shù)刺激特定的外周傷害性感受器或脊髓、脊髓上中樞神經(jīng)環(huán)路是疼痛領(lǐng)域一種重要的研究手段，該技術(shù)在急性疼痛、炎性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛的研究中應(yīng)用，有助于解析復(fù)雜的疼痛通路、闡釋疼痛敏化機制以及選擇鎮(zhèn)痛治療。

3.1急性疼痛 急性疼痛大多直接源于傷害性刺激，隨著原發(fā)病的治愈，疼痛也隨之消失，但急性疼痛具有痛覺敏化的特點，如果在初始階段未得到完全控制，則有可能發(fā)展為慢性疼痛。速激肽1型神經(jīng)元是一種與外周傷害刺激高度相關(guān)的神經(jīng)元，Barik等[37]采用cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)使ChR特異性表達于臂旁核中的速激肽1型神經(jīng)元，證實臂旁核中速激肽1型神經(jīng)元的活動極大地影響了急性疼痛引起的跳躍型逃逸反應(yīng)。故認(rèn)為，臂旁核是感知急性疼痛的腦分區(qū)，且速激肽1型神經(jīng)元是影響急性疼痛的重要單元。Xu等[38]將腺病毒裝載的ChR2注射至PFC下區(qū)和邊緣區(qū)，并使用牙科生物水泥將光纖固定于顱骨，隨后應(yīng)用熱板實驗測定實驗動物的熱痛覺敏感，證實PFC的認(rèn)知功能在疼痛調(diào)制中具有重要作用。將ChR2表達在扣帶回分裂周圍神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)了一條ACC-后島葉神經(jīng)通路，在沒有外周傷害驅(qū)動的情況下，其可誘導(dǎo)和維持傷害性疼痛敏化，這對于理解急性疼痛向慢性疼痛過渡的神經(jīng)元機制具有重要意義[39]，即“扣帶回分裂-ACC-后腦葉”對疼痛信號的傳遞可能是急性疼痛發(fā)展為慢性疼痛的轉(zhuǎn)折點，具有干預(yù)價值。

3.2炎性疼痛 炎性疼痛常由感染和損傷感染引起，具有共同的組織病理，即炎癥，絕大部分退行性病變(如頸肩腰腿痛)均屬此類，患病人群較多，涵蓋范圍較廣。Zhang等[40]構(gòu)建弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠炎性疼痛模型，將腺病毒裝載的ChR2和嗜鹽菌紫紅質(zhì)分別靶向ACC顱內(nèi)病毒注射并立體定向植入光纖，隨后藍光、黃光各10 s交替照射，分別激活和抑制ACC的神經(jīng)元活動，證實炎性疼痛對ACC神經(jīng)回路的破壞增強了厭惡情感體驗。Massaly等[41]采用cre轉(zhuǎn)基因技術(shù)使弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的炎性疼痛模型大鼠腹內(nèi)側(cè)伏隔核表達強啡肽的神經(jīng)元具有ChR2背景，從而確認(rèn)了疼痛引起的負(fù)面影響由伏隔核的Kappa阿片系統(tǒng)募集；在辣椒素誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中，研究者利用光遺傳學(xué)技術(shù)觀察到軀體感覺皮質(zhì)的興奮對三叉神經(jīng)尾核存在抑制效應(yīng)，進而抑制了疼痛感知，表明皮質(zhì)三叉神經(jīng)通路是有效的傷害感受調(diào)節(jié)通路[42]。綜上，ACC、伏隔核、三叉神經(jīng)尾核是炎性疼痛感知的責(zé)任腦區(qū)，而強啡肽、Kappa阿片系統(tǒng)、辣椒素受體均對炎性疼痛的調(diào)控有干預(yù)作用。

3.3神經(jīng)病理性疼痛 神經(jīng)病理性疼痛多由神經(jīng)變性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化及傳導(dǎo)異常等引起，如三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)卡壓等。Zhou等[43]在選擇性神經(jīng)損傷模型大鼠的PFC錐體神經(jīng)元中表達嗜鹽菌紫紅質(zhì)，然后選擇性地抑制從PFC錐體神經(jīng)元到伏隔核神經(jīng)元的軸突投射，結(jié)果顯示，抑制PFC或其向伏隔核的投射可提高大鼠的疼痛閾值，減少大鼠的厭惡癥狀，故認(rèn)為PFC到伏隔核的投射在神經(jīng)病理性疼痛調(diào)節(jié)中起重要作用；Watanabe等[44]將ChR2表達在坐骨神經(jīng)結(jié)扎小鼠的腹側(cè)被蓋區(qū)向伏隔核投射的多巴胺能神經(jīng)元，結(jié)果顯示，光激活腹側(cè)被蓋區(qū)巴胺能神經(jīng)回路增加了模型小鼠的疼痛閾值，證實中腦多巴胺能神經(jīng)元活性與伏隔核的抑制作用對調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛、癌癥疼痛具有重要價值。由此可見，PFC向伏隔核的神經(jīng)投射以及中腦的多巴胺能神經(jīng)元活性可能對神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控有重要意義。目前光遺傳學(xué)在疼痛領(lǐng)域研究的光敏離子通道、遺傳學(xué)手段、參與疼痛的解剖結(jié)構(gòu)/靶點見表2。

表2 光遺傳學(xué)在疼痛領(lǐng)域的研究

4 小 結(jié)

光遺傳學(xué)技術(shù)能精確靶向特定區(qū)域、特點表型、特點時間點的神經(jīng)元活動，其在疼痛領(lǐng)域的研究得到普遍認(rèn)可。與傳統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)方法相比，光遺傳學(xué)技術(shù)在解析外周傷害器功能、闡釋脊髓、脊髓上節(jié)段疼痛通路、探索疼痛敏化病理機制等方面具有明顯優(yōu)勢，但存在實驗成本過高、光敏感蛋白轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性較差等缺點。隨著神經(jīng)科學(xué)的不斷進步以及Crispr Cas 9等新興基因編輯工程技術(shù)的出現(xiàn)，光遺傳學(xué)技術(shù)將得到更廣泛的運用。未來疼痛領(lǐng)域的研究有望在晝夜節(jié)律、腦圖譜的繪制中取得突破性進展。