楊 艷 宇，冀 倩 倩，孫 建 東，王 健 偉，齊 洪 慶，劉 影，簡 凡 杰，李 成

(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海洋具有低溫、高壓、弱光、高鹽等特殊的生態(tài)環(huán)境特點，使得來源于海洋的微生物具有許多陸生微生物不具備的特性[1-2]。關于海洋微生物及其代謝的具有新穎的、生物學活性的次級代謝產(chǎn)物的研究日益增多，海洋微生物越來越受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。從海洋中篩選產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的海洋微生物也成為目前研究的熱點之一[3-4]。

近年來，在海洋中已經(jīng)篩選到許多具有抗菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌菌屬，包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等。汪晶晶等[5]在連云港海域海水中分離得到一株對白色念珠菌(Canidiaalbicans)的生長具有明顯的抑制作用的海洋解淀粉芽孢桿菌。Ma等[6]從海洋沉積物中篩選出來的解淀粉芽孢桿菌SH-B74，代謝物種的環(huán)脂肽pliastatin A1對番茄灰霉病的病原菌灰霉病菌B.cinerea的孢子萌發(fā)具有很強的抑制作用。田良等[7]在仿刺參飼養(yǎng)實驗中利用篩選的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌制成的復合益生菌懸液提高仿刺參生長率。魏新燕等[8]發(fā)現(xiàn)源自海洋中的一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BacillusmethylotrophicusBH21，對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)有較好拮抗作用，通過鑒定確定該菌株具有芽孢桿菌屬脂肽類抗菌物質(zhì)合成基因，且其發(fā)酵代謝相應的脂肽類物質(zhì)。在芽孢桿菌種屬中，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)作為芽孢桿菌屬的“后起之秀”，因其代謝產(chǎn)物的多樣性、對外界環(huán)境因子的多抗逆性和無污染無毒害等優(yōu)點，近年來被越來越多運用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、商業(yè)等領域[9-10]。

本實驗從大連地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖圈的海水中通過篩選得到一株對多種病原菌具有較好的抑菌效果的菌株——甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus，命名為B.methylotrophicus6112，并對其發(fā)酵代謝的抗菌物質(zhì)進行了初步的分離及鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

取自大連地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖圈的表層海水。

1.1.2 指示菌

4種指示菌(病原菌)分別為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，均為本實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，1 000 mL去離子水，pH 7.4。

通用分離液體培養(yǎng)基：牛肉膏4 g，蛋白胨4 g，酵母膏1 g，葡萄糖10 g，氯化鈉0.25 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基和通用分離固體培養(yǎng)基，均加入20 g瓊脂。

1.1.4 主要試劑和儀器

結晶紫染色液、碘液、番紅染色液等，分析純，大連美侖生物技術有限公司。

V-1000型可見分光光度計，翔藝儀器(上海)有限公司；湘儀H2050R-1醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Multiskan Go酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；MALDI-TOF，ABSCIEX中國公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的初步分離及初篩

從大連市仿刺參養(yǎng)殖圈內(nèi)采集海水樣本，按1.5%接種量接入通用分離液體培養(yǎng)基內(nèi)富集培養(yǎng)24 h。按10-1～10-9梯度稀釋后取20 μL分別涂布到固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h。再用滅菌牙簽挑取每個單菌落點樣至新的固體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在指示菌M.Lysodeikticus的平板上，進一步篩選對其有抑菌效果的菌株。

1.2.2 高產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)細菌的篩選

分別活化革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌，并制備抑菌指示平板，篩選高產(chǎn)廣譜抗菌的菌株。隨后將篩選出的菌株篩選單菌落，連續(xù)傳代培養(yǎng)，并利用牛津杯法檢測菌株對4種指示菌的抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性。

1.2.3 菌株的鑒定

將篩選的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，離心取菌體后，革蘭氏法染色，顯微鏡檢測菌體形態(tài)(1 000倍)，并觀察菌落形態(tài)。

利用16S rDNA對菌種進行鑒定。菌落PCR引物：8F，5′-CAAGTCGAGCGGACAGAT-GGGAGCT-3′；1 492R，5′-AGCTCCCATCTGTC-CGCTCGACTTG-3′。PCR反應體系(50 μL)：2×Taq PCR Mater Mix 25 μL，27F(10 μmol/L)2 μL，1 492R (10 μmol/L)2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，90 s；35次循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物送生工生物技術有限公司進行測序。經(jīng)Clustal X比對后，用軟件MEGA 7.0采用Maximum Likelihood法構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹進行鑒定。

1.2.4 菌株發(fā)酵液的抗生物膜作用

取溶壁微球菌、銅綠假單胞桿菌和燦爛弧菌菌液，用LB培養(yǎng)基將細菌濃度稀釋至108CFU/mL。取100 μL稀釋菌液加入96孔板中，對照組為200 μL的LB培養(yǎng)基，向?qū)嶒灲M內(nèi)加入50 μL目標菌體的發(fā)酵液上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸出上清培養(yǎng)基后用0.9% NaCl漂洗3次。恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后，結晶紫染色法測定生物膜含量。培養(yǎng)結束后，吸棄培養(yǎng)基，再用0.9% NaCl漂洗3次，96孔板的每個實驗孔中加入100 μL 甲醇，固定15 min，吸棄甲醇，揮干殘留甲醇后加入50 μL 0.1%結晶紫溶液，染色30 min，去除結晶紫溶液，去離子水漂洗3次后加入33%醋酸溶液溶解結晶紫，用酶標儀在570 nm處測定各個孔的吸光度。

1.2.5 酸沉法分離粗提物并檢測其抑菌活性

利用鹽酸沉淀和甲醇抽提法提取菌株發(fā)酵上清中的抑菌物質(zhì)[8，11]。菌株發(fā)酵48 h后，發(fā)酵上清液中加入6 mol/L的HCl，置于4 ℃冰箱過夜沉淀。初步分離上清和下層懸濁液后，用甲醇溶解沉淀物，用0.22 μm的有機濾膜過濾，40 ℃旋轉蒸干得到此菌株代謝的抗菌物質(zhì)的酸粗提物。

稱取3 mg粗提物溶于1 mL色譜級甲醇中制備抑菌樣品，0.22 μm濾膜除雜質(zhì)。以溶壁微球菌、銅綠假單胞桿菌和燦爛弧菌為指示菌，牛津杯法檢測其抑菌活性[12]。再利用比濁法進行活性分析，將溶壁微球菌，銅綠假單胞桿菌和燦爛弧菌接種至含100 μL培養(yǎng)基的96孔板，加入10 μL 酸沉粗提物，37 ℃培養(yǎng)24 h后，600 nm處檢測吸光度，以未加入抑菌粗提物的樣品作為對照組，每組3個平行。

1.2.6 抑菌活性物質(zhì)的初步鑒定

將目標物質(zhì)及其輔助解離的基質(zhì)物質(zhì)點樣于基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)的檢測平臺上。利用MALDI-TOF-MS及Data Explorer軟件，依據(jù)樣品的質(zhì)荷比(m/z)，測得目標物質(zhì)的相對分子質(zhì)量，通過比對初步確定菌株所產(chǎn)的脂肽類化合物的種類[13]。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離、篩選及鑒定

從刺參養(yǎng)殖海水中篩選出一株對4種指示菌均具有較好抑菌效果的菌落。菌株菌落形狀相對規(guī)則，邊緣凸起中間凹陷且相對整齊，乳白色不透明半濕潤的圓形(圖1(a))，屬于革蘭氏陽性桿菌(3 μm×1 μm)(圖1(b))。16S DNA測序后比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。結果確定該菌株與Bacillusmethylotrophicusstrain HB25(KM659226.1，99.56%)聚在同一分支，且支持率為94，親緣關系最為接近，確定實驗篩選出一株產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicu，命名為B.methylotrophicus6112。

2.2 菌株B. methylotrophicus 6112發(fā)酵液的抗細菌生物膜作用

芽孢桿菌在自然界中分布廣泛，它們能代謝分泌多種抑菌物質(zhì)，包括脂肽類、肽類以及細菌素等，其中抗菌脂肽類是芽孢桿菌種屬產(chǎn)生的最常見的一大類抑菌物質(zhì)[14]。目前，研究人員從海洋中分離的多種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌中，均發(fā)現(xiàn)含有一種或多種環(huán)脂肽類化合物[15]。因此，將檢測甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus6112是否會代謝產(chǎn)生抗菌脂肽類化合物。細菌生物膜是指附著于有生命或無生命物體表面被一些生物大分子包裹的細菌群體，具有極強的耐藥性，一旦微生物形成生物膜，常規(guī)的抗菌類物質(zhì)如抗生素類或多肽類抑菌物質(zhì)將失去抑菌作用。但是，近幾年有研究表明，芽孢桿菌屬的抗菌脂肽類物質(zhì)具有抗微生物生物膜的作用[16-17]，其能通過洞穿菌體細胞膜使其死亡或與已形成的生物膜上的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)結合導致其基本組織結構解體從而抗微生物生物膜的形成。

(a)菌落形態(tài)

注：括號中序號代表菌株序列號；分支點上的數(shù)字代表可信度，數(shù)值越大，可信度越強；標尺代表遺傳距離，標尺越短代表親緣關系越近。圖2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain

本實驗利用結晶紫染色法檢測分析甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus6112發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)對溶壁微球菌、銅綠假單胞桿菌和燦爛弧菌3種指示菌的抗生物膜作用。如圖3所示，與對照組相比，3種指示菌中加入發(fā)酵上清液后，OD600均顯著下降，尤其是仿刺參的致病菌燦爛弧菌組下降最明顯，表明發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)可以抗3種微生物形成的生物膜。推測甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus6112可能在發(fā)酵液中代謝產(chǎn)生了抗菌脂肽類物質(zhì)。

圖3 B. methylotrophicus 6112發(fā)酵液對3種不同菌形成的生物膜的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of fermentation broth of B. methylotrophicus 6112 on biofilm formed by three different strains

2.3 菌株B. methylotrophicus 6112抑菌脂肽類活性物質(zhì)的分離、提取及其活性檢測

抗菌脂肽類物質(zhì)通常是由脂肪酸鏈和肽鏈兩部分分別以內(nèi)脂或者酰胺鍵結合的方式形成，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)脂肽類物質(zhì)均具有耐強酸的性質(zhì)。因此，酸沉法是抗菌脂肽類物質(zhì)粗提取的最為常用的方法。本研究利用酸沉法結合醇萃取法提取發(fā)酵液中的脂肽類物質(zhì)，結果如圖4(a)所示。以金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌和燦爛弧菌作為指示菌，分別利用牛津杯法(圖4(b))及比濁法(圖4(c))檢測了酸沉粗提物的抑菌活性。結果表明，當培養(yǎng)基中加入適量的酸沉粗提物后，3種指示菌的生長均受到了不同程度的抑制，表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus6112發(fā)酵液的酸沉粗提物具有抑菌作用。

2.4 菌株B. methylotrophicus 6112發(fā)酵液的粗提物中的抗菌脂肽類物質(zhì)的初步鑒定

研究表明，芽孢桿菌代謝的抗菌環(huán)脂肽主要包括伊枯草菌素(Iturin)、芬薺素(Fengycin)和桿菌霉素(Surfactin)三類，它們的具體組成及相對分子質(zhì)量都是已知的。利用MALDI-TOF-MS對菌株B.methylotrophicus6112的酸沉粗提物進行解析。掃描范圍涵蓋所有已知抗菌脂肽類物質(zhì)的質(zhì)荷比(800～3 000)，發(fā)現(xiàn)粗提物抗菌脂肽質(zhì)荷比主要集中在1 000～1 600。如圖5所示，B.methylotrophicus6112的酸沉粗提物中含有多種抗菌脂肽類物質(zhì)。如表1所示，粗提物包括3種類型的抗菌脂肽類物質(zhì)：一是伊枯草菌素家族，包括伊枯草菌素C14和伊枯草菌素C15；二是芬薺素家族，包括芬薺素C15、芬薺素C16、芬薺素C17、芬薺素C18；三是桿菌霉素C15。結果表明，菌株B.methylotrophicus6112能夠代謝產(chǎn)生三類抗菌脂肽類物質(zhì)。

(a)脂肽類物質(zhì)粗提物

圖5 MALDI-TOF-MS檢測菌株B. methylotrophicus 6112發(fā)酵液酸沉粗提物質(zhì)的相對分子質(zhì)量Fig.5 The molecular weight of crude extraction of strain B. methylotrophicus 6112 fermentation supernatant obtained by acid precipitation detected by MALDI-TOF-MS

表1 MALDI-TOF-MS檢測菌株B. methylotrophicus 6112粗提物中抗菌脂肽的質(zhì)荷比Tab.1 Antimicrobial lipopeptides in crude extracts of strain B. methylotrophicus 6112 detected by MALDI-TOF-MS

盡管在所檢測的區(qū)間內(nèi)粗提物中的絕大多數(shù)成分通過比對發(fā)現(xiàn)屬于脂肽類化合物，但也存在不確定的成分，如m/z=1 100 處的物質(zhì)不能確定具體組分；同時待測物為粗提品，因此實驗不能確定菌株B.methylotrophicus6112是否還能產(chǎn)生其他類型的抑菌活性物質(zhì)，這需要進一步的分離、純化及分析、鑒定。

3 結 論

以溶壁微球菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌4種病原菌作為指示菌，從大連市仿刺參養(yǎng)殖圈的海水中篩選出1株能夠產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus6112。結果表明，B.methylotrophicus6112能產(chǎn)生3種抗菌脂肽類物質(zhì)，分別為伊枯草菌素、芬薺素以及桿菌霉素。