王 蕊，楊正飛

（寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏銀川 750004）

缺血性卒中（cerebral infarction，CI）是栓子阻塞血管，使入顱血流量減少，引起腦組織供血障礙，繼而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能受損的一類疾病，嚴重危害人類健康［1-3］。此外，CI 常會誘發(fā)其他器官的損害，尤以心臟損害多見，后者表現(xiàn)為心律失常、心肌損害、心電圖改變、心肌酶譜異常甚至急性心肌梗死［4-7］，進而加重病情，影響患者預(yù)后。目前，對CI 后誘發(fā)心功能障礙的機制研究較少［8］，迄今尚未闡明。因此，本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室的基因芯片數(shù)據(jù)，分析二者存在的差異基因，以期分析缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的機制，并為腦卒中相關(guān)心功能障礙的治療提供依據(jù)；同時，為其他相關(guān)疾病的研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

以美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO DataSets 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）為檢索對象，檢索時間截止于2019 年12 月，以“Cerebral infarction and cardiac dysfunction”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取24、72 h 兩個時間點MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室中基因芯片數(shù)據(jù)GSE102558。

1.2 研究方法

下載基因芯片數(shù)據(jù)GSE102558，并通過R 語言軟件進行編程、分析，設(shè)定篩選條件logFC 絕對值≥1，校正P＜0.05，獲取這兩個時間點MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室中的差異表達基因；同時，利用R語言軟件繪制差異基因的火山圖和前20 位差異基因的熱圖。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在線分析工具，對24 h 和72 h 的MCAO 小鼠與Sham小鼠左心室中的差異表達基因進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析[9]。其中，以小鼠為物種篩選條件，設(shè)置Select Identifier 為“Official Gene Symbol”，List Type 為“Gene List”，選擇生物過程、細胞組成和分子功能模塊對差異基因進行GO 功能富集分析；同時，選擇Pathways 進行KEGG 通路富集分析。最后，運用Omicshare（http://www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）在線分析工具對富集分析結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 原始數(shù)據(jù)篩選

本研究為避免如品種、年齡等因素對基因表達的干擾，故根據(jù)小鼠品系、鼠齡、分組以及取樣部位相同的原則對原始數(shù)據(jù)進行篩選，最終選擇8 周齡C57BL/6J 小鼠，取樣部位為左心室。經(jīng)篩選，符合要求的數(shù)據(jù)顯示，Sham-24 h 組、MCAO-24 h 組、Sham-72 h 及MCAO-72 h 組均具有6 個樣本數(shù)據(jù)；具體樣本數(shù)據(jù)信息見表1。

表1 樣本數(shù)據(jù)信息Tab 1 Sample data information

2.2 差異基因篩選

對原始數(shù)據(jù)進行整理，將缺血24 h 和72 h 的數(shù)據(jù)按Sham 組和MCAO 組進行分組，使用R 語言軟件對整理的數(shù)據(jù)進行一致性評價，選擇相關(guān)系數(shù)＞0.9 的樣本，確保準確檢測到缺血性卒中誘導(dǎo)后出現(xiàn)心功能障礙的差異基因；對Sham 組及MCAO 組數(shù)據(jù)進行分析后，發(fā)現(xiàn)缺血后24 h 和72 h 的Sham 組和MCAO 組樣本數(shù)據(jù)中差異基因分別有187 個和51 個（圖1），圖中紅色圓點代表上調(diào)基因，綠色圓點代表下調(diào)基因，黑色圓點代表未變化的基因；分別列出調(diào)控最顯著的前20 位差異基因及表達值（圖2），圖中顏色越紅代表基因表達值變化越大。結(jié)果顯示，缺血24 h 變化最顯著的前10 位差異基因分別 為 ：Nr4a1、Tacc2、Pnpla2、Aplnr、Arrdc2、Map3k6、Itgb6、Cblb、Tuba4a 和Bnip3；缺血72h 變化最顯著的前10 位差異基因分別為：Myh7、Gm12295、Itgb6、C130080G10Rik、Hmgcs2、Cmss1、Lrrc52、Fam107a、Lcn2 和Aplnr。其中，Aplnr、Itgb6兩個基因在24 h 與72 h 均發(fā)生變化。

圖1 差異基因的火山圖Fig 1 Volcanic map of differential genes

圖2 前20 位差異基因的熱圖Fig 2 Heat map of the first 20 differential genes

2.3 GO 功能富集分析

對24、72 h 缺血性卒中誘導(dǎo)后出現(xiàn)心功能障礙的差異基因影響的生物過程、細胞組成和分子功能，運用DAVID 6.8 在線分析工具對差異基因進行GO 功能富集分析后，得出具體結(jié)果如下：

在缺血后24 h，得到100 個GO 條目，篩選P＜0.05 作為顯著性富集，得到56 條具有顯著意義的條目：在生物過程方面，有30 條（53.57%）顯著富集條目，涉及整合素介導(dǎo)的細胞黏附負調(diào)控、膠原纖維組織、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)及細胞凋亡過程的負調(diào)節(jié)等；在細胞組成方面，有11 條（19.63%）顯著富集條目，主要涉及線粒體膜、細胞外基質(zhì)及細胞質(zhì)等；在分子功能方面，有15 條（26.78%）顯著富集條目，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

在缺血后72 h，得到23 個GO 條目，篩選P＜0.05 作為顯著性富集，得到14 條具有顯著意義的條目：在生物過程方面，有9 條（64.28%）顯著富集條目，涉及活性氧的種類代謝過程、肌肉收縮、細胞基質(zhì)附著力、自噬細胞死亡、整合素介導(dǎo)的信號通路及程序性細胞死亡的正向調(diào)節(jié)等；在細胞組成方面，有4 條（28.57%）顯著富集條目，主要涉及MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、蛋白質(zhì)的細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)的錨定成分和膜錨定成分；在分子功能方面，有1 條（7.14%）顯著富集條目，主要涉及整合素結(jié)合。結(jié)果見圖3。

圖3 前10 位GO 功能富集Fig 3 Top 10 of GO function enrichment

2.4 KEGG 通路富集分析

運用DAVID 6.8 在線分析工具對差異基因進行KEGG 通路富集分析，得出具體結(jié)果如下。

缺血后24 h，共富集到9 條通路，篩選P＜0.05作為顯著性富集，得到5 條顯著富集通路，主要涉及的信號通路是癌癥中的小RNA、生理節(jié)律、HTLV-I 感染、PI3K-Akt 信號通路和化學致癌性。

缺血后72 h，共富集到4 條通路，篩選P＜0.05作為顯著性富集，得到3 條顯著富集通路，主要涉及的信號通路是PI3K-Akt 信號通路、酮體的合成與降解、細胞外基質(zhì)-受體相互作用。

運用Omicshare 在線分析工具對富集分析結(jié)果進行可視化，結(jié)果見圖4。

圖4 差異基因的KEGG 通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of differential genes

3 討論

自1937 年，Dozzy 首次對腦血管病可伴心臟功能障礙進行報道以來，越來越多的學者證實了腦血管病可導(dǎo)致心肌損害，出現(xiàn)心肌酶升高、心律失常、心肌損傷及急性心肌梗死等臨床表現(xiàn)，即出現(xiàn)腦心綜合征［5］。目前，隨著腦梗死患者越來越多，腦心綜合征的發(fā)病率已占所有急性腦梗死患者的78.3%［10］，并成為腦卒中患者急性期猝死的主要原因［11］，但由于其機制尚不清楚，臨床上只能對癥處理，故療效差，治療上較被動［12］。因此，對缺血性卒中后誘發(fā)心功能障礙的機制進行研究將成為今后重要的研究課題。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫（GEO），獲得缺血性卒中后誘發(fā)心功能障礙的差異表達基因及相關(guān)通路。結(jié)果表明：隨著腦缺血時間的延長，在缺血后24 h和72 h，會出現(xiàn)不同的差異表達基因，其中，Aplnr、Itgb6 兩個基因在24 h 與72 h 均發(fā)生差異表達。Aplnr 是一個典型的G 蛋白偶聯(lián)受體，是apelin 的唯一受體，存在于冠狀動脈和肺血管的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞以及心肌與多區(qū)域的腦組織中；Aplnr 主要通過G 蛋白的亞基（Gαi 或Gαq）來介導(dǎo)信號，Gαi有助于PI3K/AKT 的活化和ERK 的激活，Gαq 有助于PLCβ/PKC 的激活；在心肌與腦組織缺血、缺氧早期，會促進Aplnr 的表達，從而通過激活PI3K/AKT 和ERKs 信號通路抑制細胞凋亡和促進血管新生［13］。Itgb6 可調(diào)節(jié)擴散、遷移、細胞外基質(zhì)降解等細胞基本功能［14］。對差異基因做進一步的GO 功能富集與KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，腦缺血的不同時間段會引起心臟發(fā)生不同的生物學功能及信號通路改變，而PI3K-Akt 信號通路是兩個時間段都會涉及的共同信號通路，因此，可以預(yù)測出PI3K-Akt 信號通路為缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的主要通路。在PI3K-Akt 信號通路中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）廣泛存在于心肌細胞，參與生理病理過程，如細胞凋亡、壞死，細胞自噬，細胞存活與分化等［15］，PI3K 分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，其中，Ⅰ類在多種通路中發(fā)揮作用。蛋白激酶B（Akt）是一種廣泛存在于人體各組織中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在Akt1、Akt2 和Akt3 三種亞型［16］，其中，Akt1 和Akt3 廣泛表達于人體細胞，Akt2 主要在肝臟和骨骼肌等組織中表達［17，18］，而Akt 被認為是PI3K-Akt 信號通路的關(guān)鍵。研究表明，PI3K-Akt 信號通路可通過多種機制調(diào)節(jié)心血管功能［19］，如Sun 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 信號通路具有心臟保護作用，激活PI3K-Akt 信號通路，可改善心肌損傷，并抑制心臟肥大的發(fā)生；Ogita 等［21］通過實驗發(fā)現(xiàn)，激活PI3K-Akt 信號通路可改善冠狀動脈灌注、心臟收縮及心肌代謝功能。因此，PI3K-Akt 信號通路與心臟功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，主要通過影響心肌細胞存活、增殖、凋亡以及心肌細胞能量代謝及調(diào)節(jié)，血管再生等方面，實現(xiàn)對心臟的調(diào)節(jié)作用。當發(fā)生腦梗死時，腦部血流量減少，引起腦水腫，損害島葉皮質(zhì)及皮質(zhì)下聯(lián)合纖維，使血液中兒茶酚胺的含量增加，也可通過影響神經(jīng)、體液等多方面因素影響心臟功能，從而引起腦心綜合征［22］。同時，本研究預(yù)測結(jié)果得出：缺血性卒中后通過影響PI3K-Akt 信號通路的心臟調(diào)節(jié)作用，引起心臟功能障礙。

綜上所述，缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的機制主要涉及PI3K-Akt 信號通路。當心肌持續(xù)缺血時，該通路對抑制心肌細胞凋亡和減緩心功能惡化速度等方面具有積極的作用［23］。因此，研發(fā)調(diào)控PI3K-Akt 信號通路的相關(guān)藥物，可能是治療缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的重要方向。