車 彪，王世東，陳小愚，李 娜，唐 誠

（北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌2 區(qū)，北京 100700）

2 型糖尿?。═2DM）是一種以慢性高血糖為主要表現(xiàn)的代謝性疾病。T2DM 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（interational diabetes federation，IDF）統(tǒng)計，2013 年全球已有3.82 億糖尿病患者，預計到2035 年，患者將增至5.92 億［1］。長期血糖控制不佳會導致心、腦、腎、足等組織器官損害，引發(fā)諸多并發(fā)癥。T2DM 嚴重威脅人類的生命健康，增加社會經(jīng)濟負擔，因此防治糖尿病對人類的健康意義深遠。中藥復方在改善T2DM 癥狀、延緩并發(fā)癥等方面具有一定優(yōu)勢，對中藥復方的發(fā)掘與研究對防治T2DM 具有重要意義。著名名老中醫(yī)祝諶予教授開近代活血化瘀法治療T2DM 先河，丹參、葛根為其所創(chuàng)的代表性“活血對藥”［2］。丹參養(yǎng)血活血、涼血化瘀，葛根生津止渴，舒筋活絡，兩藥常用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。然而，丹參、葛根治療T2DM 的作用機制尚未完全明了，本研究應用網(wǎng)絡藥理方法，試對丹參、葛根治療T2DM 作用機制進行研究，以揭示其科學內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 化學成分篩選及靶點預測

以丹參、葛根藥對為研究對象，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）進行化學成分的查詢及篩選［3］，選取口服利用度（oral bioavailability，OB≥30% 且類藥性（drug-likeness，DL≥0.18 的化學成分作為候選成分，并查閱相關文獻資料對化學成分進行補充［4，5］。篩選結束后，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根據(jù)化學成分名稱查詢相應的SMILE 號，并導入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.Swisstarget prediction.ch）進行靶點預測［6］。 在Unitprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.Uniprot.org）中查詢靶點的基因名，對靶點進行標準化處理。

1.2 T2DM 相關靶點篩選

以“type 2 diabetes mellitus”、“type 2 diabetes”等為關鍵詞，篩選GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca）、Disgenet 數(shù)據(jù)庫（https：//www. disgenet. org）中T2DM 的相關靶點。合并4 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復值作為疾病候選靶點。在Unitprot 數(shù)據(jù)庫中查詢靶點的基因名，對候選靶點進行標準化處理。

1.3 PPI 網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

獲取候選成分的相關靶點及T2DM 的候選靶點之后，對兩者靶點取交集，并將交集靶點導入STRING11.0 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）中，選擇生物物種為homo sapiens（human），繪制蛋白質-蛋白質互作關系（PPI）網(wǎng)絡圖［7］。通過Cytoscape 3.8.0 軟件對交集靶點的PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析，選擇各節(jié)點連接度（degree）的2 倍中位數(shù)值、介度（betweenness）的中位數(shù)值及緊密度（closeness）的中位數(shù)值為最低閾值，對PPI 網(wǎng)絡中靶點進行篩選。PPI 網(wǎng)絡反映了靶點之間的相互作用關系，通過拓撲參數(shù)篩選后的靶點傳遞信息更高，影響節(jié)點更多，為PPI 網(wǎng)絡中的關鍵靶點。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析

將2.3 中獲取的關鍵靶點導入Metascape 平臺（http：//metascape.org/gp/index.html），設置P＜0.01，選擇生物過程、分子功能和細胞組分、生物學通路4 個模塊，對關鍵靶點進行GO 功能及KEGG通路富集分析［8］，保存數(shù)據(jù)結果，并應用R 語言對數(shù)據(jù)進行可視化。

2 結果

2.1 化學成分篩選及靶點預測結果

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫并結合相關文獻查閱初步提取丹參化學成分202 種，葛根化學成分50 種；根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 的要求，選定化學成分70 種，其中來源于丹參65 種，葛根5 種（表1）。將70 種化學成分導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中進行靶點預測，共得到化學成分靶點506 個。

表1 丹參、葛根藥對化學成分Tab 1 Chemical constituents of Salvia miltiorrhiza（S. miltiorrhiza）and Pueraria lobata（P. lobata）

2.2 T2DM 相關靶點篩選結果

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選出T2DM 相關靶點1 298 個，TTD 數(shù)據(jù)庫中篩選出T2DM 相關靶點10 個，DrugBank 數(shù)據(jù)庫中篩選出T2DM 相關靶點34 個，Disgenet 數(shù)據(jù)中篩選出T2DM 相關靶點6 個，合并后刪除重復值，最終得到1 328 個T2DM 相關靶點。

2.3 PPI 網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選結果

取化學成分靶點與T2DM 相關靶點交集，共得到219 個交集靶點。 將571 個交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，構建PPI 網(wǎng)絡，結果見圖1（A）。選取交集靶點PPI 網(wǎng)絡中各節(jié)點連接度的2 倍中位數(shù)值（16）、介度的中位數(shù)值為（110.88）、緊密度的中位數(shù)值為（0.35）為最低閾值進行靶點篩選，共得到關鍵靶點51 個（見表2），對51 個關鍵靶點進行PPI網(wǎng)絡構建，結果見圖1（B）。51 個關鍵靶點歸屬于41 種化合物，包括丹參37 種，葛根4 種。

表2 丹參、葛根藥對關鍵靶點Tab 2 S. miltiorrhiza and P. lobata key targets

圖1 PPI 網(wǎng)絡圖Fig 1 PPI network diagram

2.4 GO 及KEGG 通路富集分析

為進一步闡明關鍵靶點的可能作用，應用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對關鍵靶點進行GO 及KEGG通路富集分析，共得到71 個細胞組分，85 個分子功能，559 個生物過程及137 條信號通路，使用R 語言對前20 條富集分析結果進行可視化，可視化結果見圖2。由GO 分析結果可見，靶點基因涉及細胞膜筏、細胞膜微域、突觸后膜等細胞組分（圖2A）。在分子功能上（圖2B）主要集中在蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶結合、胰島素受體底物結合等功能，這些功能在生物過程上（圖2C）可能與細胞對有機氮化合物的反應、細胞對氮化合物的反應、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細胞對激素刺激的反應等過程密切相關。KEGG 結果顯示，關鍵靶點主要富集于AGE-RAGE 信號通路、P13K-Akt 信號通路、ErbB 信號通路、胰島素抵抗、HIF-1 等信號通路，見圖2D、表3。

表3 關鍵靶點KEGG 通路富集結果Tab 3 Results of KEGG pathway enrichment analysis of key targets

圖2 GO 與KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig 2 Bubble diagram of GO and KEGG pathway enrichment analysis

2.5 成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡圖

應用Cytoscape 3.8.0 軟件對丹參、葛根藥對預測的51 個靶點及相對應的41 種化學成分，以及靶點相對應的主要通路進行分析，構建核心藥物組合成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡圖，見圖3。

圖3 核心藥物組合成分-關鍵靶點-通路網(wǎng)絡圖Fig 3 Diagram of core drug composition-key target-pathway network

3 討論

丹參味苦，性微寒，可祛瘀生新，涼血消癰，《本草綱目》記載：“能破宿血，補新血”。葛根有生津止渴，舒筋活絡之功，且其性味辛散，有助血液運行，如《本草經(jīng)解》有言：“諸痹皆起于氣血不流暢，葛根辛甘和散，氣血活，諸痹自愈也?！钡⒌酶鸶嘀?，其活血之力更強，適用于T2DM 內(nèi)熱傷陰且瘀血癥狀較為突出者。現(xiàn)代藥理學表明葛根素聯(lián)合丹參酮ⅡA 能減輕糖尿病大鼠微血管病變，抑制其炎癥反應，且其配伍使用效果好于單藥［9］。多項丹參、葛根聯(lián)合治療T2DM 的相關臨床研究顯示，丹參、葛根藥對在改善T2DM 癥狀方面療效顯著［10，11］，這些均提示丹參、葛根藥對在治療T2DM 中的重要作用。

T2DM 發(fā)病機制復雜，且中藥復方成分、靶點及通路眾多，對丹參、葛根治療T2DM 的作用機制尚未完全闡明。本研究通過網(wǎng)絡藥理學研究方法系統(tǒng)預測了丹參、葛根在治療T2DM 的潛在化學成分、關鍵靶點、分子機制及相關通路。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，共篩選出70 種化學成分，51 個化學成分與疾病共同作用靶點，137 條潛在信號通路，這些結果都反映了丹參、葛根在治療T2DM 過程中的潛在作用機制。

51 個關鍵靶點中，PIK3CA 連接度最高。研究表明，PIK3CA 可能與影響血管生成、細胞對葡萄糖刺激的反應及葡萄糖代謝過程相關［12］。PIK3CA 可激活參與細胞生長、存活、增殖、運動和形態(tài)的信號級聯(lián)反應，從而發(fā)揮關鍵作用。除PIK3CA 外，MAPK3 及MAPK1 也與丹參、葛根多種化合物及靶點相關。MAPK3 和MAPK1 是在MAPK/ERK 級聯(lián)中起重要作用的兩個MAPK［13］，MAPK/ERK 通路在糖尿病及其并發(fā)癥過程中起重要作用［14］。富集分析結果中，關鍵靶點主要富集于AGE-RAGE、P13K-Akt、ErbB、胰島素抵抗、HIF-1 等信號通路。AGE-RAGE 信號通路是糖尿病微血管并發(fā)癥形成與發(fā)展過程中的重要一環(huán)，現(xiàn)代研究表明，丹參酮ⅡA 能降低晚期糖化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導下人腎小球系膜細胞的RAGE 表達及氧化應激水平，即通過阻斷AGE-RAGE 信號通路起到抵抗糖尿病腎臟病進展的作用［15］。P13K-Akt 信號通路失調(diào)見于癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)疾病等多種疾病，其介導參與細胞社長發(fā)育的多個過程，ErbB 信號通路是P13K-Akt 的重要上游通路［16］。研究表明葛根素可上調(diào)P13K、AKT、AMPK、PPARγ 基因和蛋白表達，從而增加葡萄糖運轉，改善胰島素抵抗［17］。HIF-1 信號通路在血管再生、葡萄糖和能量代謝、細胞增殖等多個生物過程中起作用，Zhou 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，丹參中丹酚酸B 可抑制血管新生，其機制可能與丹酚酸B 抑制HIF-1α、VEGF 表達有關。這些研究都提示了本研究預測的靶點及信號通路的可行性。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學研究方法，對丹參、葛根藥對治療T2DM 的化學成分、靶點、通路之間進行研究，體現(xiàn)了丹參、葛根藥對多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點。但丹參、葛根藥對治療T2DM 的作用機制仍有待后續(xù)動物或細胞試驗的證實。