張永濤，趙丹，安全，張佳嬋，王昌濤，3，李萌*

（1.北京工商大學 化學與材料工程學院 北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048；2.云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650504；3.北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

青刺果（Prinsepia utilis Royle）又名青刺尖、打油果等，是薔薇科扁核木屬植物總花扁核的果實，主要生長在四川、貴州、云南和西藏等地區(qū)。青刺果常用于治療皮膚燒傷、跌打損傷、攻毒、活血、祛瘀等[1]?，F(xiàn)代研究表明，青刺果內(nèi)富含黃酮和多酚類化合物[2]，具有較好的抗氧化、降血糖血脂、抗炎等功效[3-6]，因此青刺果的提取成分多被用于藥品、食品和化妝品中[7-8]。

紫外線（ultraviolet，UV）是導致皮膚衰老、損傷重要的原因之一，尤其是在長期的長波紫外線（ultraviolet A，UVA）（320 nm～400 nm）輻照下會對皮膚真皮層造成細胞損傷，導致皮膚發(fā)生光損傷、光老化甚至光致癌[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，UVA照射培養(yǎng)人成纖維細胞后，會使細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平提高而產(chǎn)生氧化應激反應，伴隨著抗氧化酶適應性上調(diào)。這些抗氧化酶，尤其是過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達，能進一步增強人成纖維細胞對UVA的光保護[11]。

已有研究表明，黃酮類化合物和多酚類化合物具有很好的抗氧化作用，對UVA損傷的人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF）有很好的修復作用[12-14]。研究表明微生物發(fā)酵作為一種天然產(chǎn)物提取的方法存在降低提取物毒性、分解物質(zhì)為易吸收的小分子活性物質(zhì)或修飾物質(zhì)結構以增強功效活性等優(yōu)點[15-17]，本研究對比了青刺果發(fā)酵液（fermentation extract of P.utilisRoyle，F(xiàn)EP）和青刺果水提液（waterextractofP.utilis Royle，WEP）中總黃酮和總多酚的含量，并分析兩者對UVA誘導損傷后的人皮膚成纖維細胞的修復作用，旨在分析FEP與WEP存在的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青刺果：云南白藥集團股份有限公司；德氏乳桿菌保加利亞亞種（CICC 20247）：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司；人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblast，HSF）：中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心；焦性沒食子酸：國藥集團化學試劑有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、鏈霉素、青霉素、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：美國 GIBCO 生命技術公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、TransStartTop Green qPCR SuperMix試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；蘆丁標準品、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）：上海麥克材生化科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒：百瑞極生物科技有限公司；總RNA抽提試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒：碧云天生物技術有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋（SY21-Ni4型）：北京市精科華瑞儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（HWS智能型）：寧波江南儀器廠；超凈工作臺（YJ－2450型）：蘇州凈化設備廠；高速臺式冷凍離心機（Sigma 3-18KS）：德國Sigma公司；電子天平（ME104E型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標儀（Tecan Sunrice）：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；超聲波細胞破碎儀（BILON-1500Y型）：上海比朗儀器制造有限公司；CO2培養(yǎng)箱（HeracellTMVIOS 250i）、實時熒光定量PCR儀（Quantudio3-Real Time）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TLD18WBLB無臭氧UVA燈：飛利浦中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 WEP的制備

稱取粒徑為50目的青刺果粉20 g，以料液比1∶15（mg/mL）加去離子水，在70℃水浴搖床中提取3 h，4 900 r/min離心15 min，取上清液過膜備用。

1.3.2 FEP的制備

稱取粒徑為50目的青刺果粉20 g，以料液比1∶15（mg/mL）加入去離子水，120℃高溫滅菌 20 min，冷卻后接入5%的德氏乳桿菌擴培菌液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d后高溫滅菌20 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜備用。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照文獻[18]的方法測定WEP和FEP中總黃酮的含量，設置 6個梯度（0.2 mg/mL～0.7 mg/mL）的蘆丁標準溶液，用酶標儀測定A510，分別以蘆丁標準溶液的濃度和吸光度為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。得到標準曲線為y=0.855 4x+0.000 6（R2=0.9965）。分別吸取1mL的WEP和FEP，按同樣方法進行試驗，測定A510，代入標準曲線計算總黃酮含量。

1.3.4 總多酚含量測定

參照文獻[19]的方法測定WEP和FEP中總多酚含量，設置焦性沒食子酸的濃度梯度，用酶標儀測定A765，分別以沒食子酸的濃度和吸光度為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。得到標準曲線為y=0.8591x+0.0793（R2=0.9982）。準確稱取 0.5mL 的WEP和FEP，按照同樣方法進行試驗，測定A765，代入標準曲線計算總多酚含量。

1.3.5 DPPH自由基清除試驗

DPPH自由基清除試驗的操作方法參考文獻[20]，測定不同稀釋倍數(shù)的WEP和FEP的DPPH自由基的清除率，測定在517 nm處的吸光度，根據(jù)以下公式計算WEP和FEP的DPPH自由基清除率。

式中：A1為空白對照組吸光度；A2為待測樣品組吸光度；A3為無水乙醇和樣品溶劑對照組吸光度；A4為無水乙醇溶劑對照組吸光度。

1.3.6 細胞培養(yǎng)

將HSF細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。細胞保存在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。所有細胞試驗在第3代和第6代之間的細胞基礎上進行。

1.3.7 UVA誘導損傷

將人皮膚成纖維細胞以3×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，在37℃的DMEM完全培養(yǎng)液中孵育24 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，并覆蓋一層薄薄的PBS。使用配備15 W無臭氧UVA燈的UV光療儀器將HSF細胞以18 J/cm2的劑量暴露于UVA照射2.5 h。暴露于UVA后將細胞分別在含有WEP和FEP的完全培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h。

1.3.8 細胞活性測定

取對數(shù)生長期的HSF細胞用0.05%的胰酶消化細胞2 min～5 min，用DMEM完全培養(yǎng)液停止胰酶消化，經(jīng)離心稀釋成細胞濃度大約為8×104個細胞/mL～1×105個細胞/mL 細胞懸液，以 100 μL/孔接種于 96 孔板中（每孔8×103個～1×104個細胞），空白孔每孔 100μL PBS，培養(yǎng)12 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，設置6組平行，每孔加入100 μL配制好的6個濃度梯度的樣品溶液 （0.125%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、5.00%），對照組加100 μL無血清的DMEM，空白孔加100 μL PBS，培養(yǎng)24 h；倒掉培養(yǎng)液，用 PBS洗滌 2次，所有孔加入100 μL無血清DMEM和10 μLCCK8試液，孵育2 h～3 h，用酶標儀測定A450。UVA誘導損傷模型組按以上同樣的方法，測定A450。按照以下公式計算細胞存活率。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為對照組吸光度；A3為空白組吸光度。

1.3.9 HSF細胞內(nèi)ROS水平測定

按檢測試劑盒中方法測定細胞內(nèi)ROS含量。暴露于UVA后的HSF用體積分數(shù)分別為0.50%、1.00%、2.00%的WEP和FEP的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，倒掉樣品溶液并用PBS清洗2次，后續(xù)步驟按照試劑盒給定的方法進行操作，并使用熒光酶標儀在488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長處檢測WEP和FEP處理后細胞內(nèi)ROS的熒光強度。

1.3.10 HSF細胞抗氧化能力測定

按照總抗氧化能力檢測試劑盒測定FEP和WEP對UVA誘導損傷后HSF細胞的總抗氧化能力。根據(jù)樣品對細胞存活率的影響結果，最終選擇體積分數(shù)為5.00%、2.00%、1.00%的青刺果發(fā)酵液，作用于UVA誘導損傷的HSF細胞24 h，收集約1×106個細胞，在200 μL PBS中，用超聲充分破碎細胞，釋放HSF中的抗氧化物，4℃下12 000×g離心5 min，取上清液用于后續(xù)測定。按照總抗氧化能力檢測試劑盒給定的方法進行試驗操作，最后用酶標儀測定A734，根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.3.11 HSF細胞內(nèi)CAT活力測定

按照過氧化氫酶檢測試劑盒給定的方法，分別配制濃度分別為 0、0.625、1.25、2.5、3.75 mmol/L 的過氧化氫溶液，各取4 μL和200 μL顯色工作液加入96孔板中，在25℃下至少孵育15 min后用酶標儀測定A520，并繪制標準曲線。分別取4 μL經(jīng)青刺果水提液和發(fā)酵液處理24 h的細胞裂解液于1.5 mL離心管中，加入37 μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10 μL 250 mmol/L過氧化氫，充分混勻后反應5 min，加入450 μL過氧化氫酶反應終止液，充分混勻以終止反應。在離心管中加入40 μL過氧化氫酶檢測緩沖液和10 μL已終止并混勻的反應體系，混勻，在25℃條件下孵育15 min后，利用酶標儀測定A520，并用試劑盒方式計算過氧化氫酶活力。

1.3.12 總RNA提取和反轉錄

按照總RNA抽提試劑和反轉錄試劑盒中的要求進行RNA的提取和反轉錄試驗。

1.3.13 引物及探針的設計和合成

根據(jù)美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 發(fā)布的序列基因，用Primer Express軟件設計出目的基因的特異性引物（包含管家基因β-actin），如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3.14 實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中的試驗數(shù)據(jù)均利用Prism9軟件進行統(tǒng)計學分析處理，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所得結果以（平均值±標準差）表示。

2 結果與分析

2.1 WEP和FEP中總黃酮和總多酚含量

WEP和FEP中總黃酮、總多酚含量測定結果見圖1。

圖1 WEP和FEP中總黃酮及總多酚含量Fig.1 The content of total flavonoids and total polyphenols in WEP and FEP

由圖1所示，WEP總黃酮含量為（3.73±0.25）μg/mL，總多酚含量為（4.54±0.22）μg/mL；FEP中，總黃酮含量為 （7.24±0.19）μg/mL，總多酚的含量為（8.89±0.21）μg/mL。FEP中總黃酮和總多酚的含量均高于WEP，且存在高度顯著的差異性（p<0.001）。

2.2 WEP和FEP體外抗氧化能力

WEP和FEP對DPPH自由基清除率如圖2所示。

圖2 WEP和FEP體外抗氧化能力Fig.2 In vitro antioxidant capacity of WEP and FEP

由圖2A可知，WEP和FEP在稀釋0到15倍之間，均具有很高的DPPH自由基清除率，未有明顯的差別，隨著稀釋倍數(shù)的加大，二者對DPPH自由基清除能力的差異也越來越顯著，由圖2B可知，當DPPH自由基清除率在50%時，WEP和FEP的稀釋倍數(shù)分別為54.797倍和86.446倍，F(xiàn)EP是WEP的1.58倍。由此可見，F(xiàn)EP的DPPH自由基清除能力明顯強于WEP。

2.3 WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF模型的修復作用

2.3.1 WEP和FEP對HSF細胞活性的影響

WEP和FEP對HSF細胞活性的影響如圖3所示。

圖3 WEP和FEP對HSF細胞活性的影響Fig.3 Effects of WEP and FEP on HSF cell activity

由圖3 A可知，當樣品濃度在0%～2%時，細胞存活率在85%以上，濃度為0.25%和0.5%時，WEP和FEP之間存在極顯著（p<0.01）和高度顯著的差異（p<0.001）。由圖3B可知，F(xiàn)EP的80%最大效應濃度比WEP高，可見FEP對細胞的毒性更低；由圖3C可知，不同濃度的WEP和FEP對UVA損傷后的HSF細胞都有不同程度的修復作用。總體來看，F(xiàn)EP對HSF細胞的毒性和修復能力更強。并按照結果綜合分析選擇了3個濃度進行后續(xù)試驗，分別為0.5%、1.0%和2.0%。

2.3.2 WEP和FEP對HSF內(nèi)ROS水平的影響

在探究WEP和FEP對UVA誘導的損傷后HSF的抗氧化作用中，分別使用0.50%、1.00%、2.00%的WEP和FEP處理UVA誘導的損傷后的HSF細胞，使用活性氧檢測試劑盒檢測HSF細胞中的ROS含量，結果如圖4所示。

由圖4可知，空白對照組ROS水平高度顯著低于UVA誘導損傷后的ROS水平（p<0.001）；而樣品組相比于UVA模型組，WEP和FEP均顯著降低了UVA誘導損傷后HSF內(nèi)ROS水平；并且在濃度為0.50%和1.00%時，F(xiàn)EP與WEP分別存在高度顯著差異（p<0.001）和極顯著差異（p<0.01）。結果表明，F(xiàn)EP 在降低UVA誘導損傷的HSF內(nèi)ROS水平的能力強于WEP。

圖4 WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF內(nèi)ROS水平的影響Fig.4 The effect of WEP and FEP on the level of ROS in HSF induced by UVA

2.3.3 WEP和FEP對細胞總抗氧化能力的影響

考察3個濃度的WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF的總抗氧化能力，結果如圖5所示。

圖5 WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF總抗氧化能力的影響Fig.5 The effect of WEP and FEP on the total antioxidant capacity of UVA-induced damage to HSF

由圖5可知，與UVA損傷模型相比，WEP只有在1.0%時有統(tǒng)計學差異（p<0.05），而不同濃度的FEP都存在顯著性差異（p<0.01，p<0.001），由此表明，F(xiàn)EP 的總抗氧化能力明顯強于WEP。

2.3.4 WEP和FEP對HSF內(nèi)CAT酶活性的影響

考察3個濃度的WEP和FEP對UVA損傷后的HSF的過氧化氫酶活力的影響，結果如圖6所示。

圖6 WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF內(nèi)過氧化氫酶活性的影響Fig.6 The effect of WEP and FEP on catalase activity in HSF induced by UVA

由圖6可知，相比于UVA模型組，WEP和FEP能高度顯著促進過氧化氫酶活力（p<0.001）；并且在0.5%和1.0%時WEP和FEP相比對過氧化氫酶活力的促進作用分別有極顯著差異（p<0.01）和高度顯著差異（p<0.001），即FEP對損傷后HSF的過氧化氫酶活力有更強的促進作用。

2.3.5 WEP和FEP對HSF內(nèi)CAT mRNA表達水平的影響

通過實時熒光定量PCR對過氧化氫酶mRNA的表達水平的分析，結果如圖7所示，

圖7 WEP和FEP對UVA誘導損傷的HSF內(nèi)過氧化氫酶表達水平的影響Fig.7 The effect of WEP and FEP on the expression level of catalase in HSF with UVA-induced damage

由圖7可知，空白對照組細胞內(nèi)過氧化氫酶mRNA的表達水平高度顯著于UVA誘導損傷的細胞。而樣品組相比于UVA模型組，WEP和FEP對過氧化氫酶mRNA的表達水平的提升都有高度顯著作用（p<0.001）。WEP和FEP對提升過氧化氫酶表達作用在濃度為1.0%時有顯著差異（p<0.05），在濃度為2.0%時存在極顯著差異（p<0.01），在濃度為0.5%時存在高度顯著差異（p<0.001）。由此可知，F(xiàn)EP對提升過氧化氫酶表達的作用更強。

3 結論

本試驗分別通過微生物發(fā)酵法和水提取法制得青刺果提取物FEP和WEP，F(xiàn)EP中總黃酮和總多酚的含量分別達到了（7.24±0.19）、（8.89±0.21）μg/mL，約為水提液含量的兩倍左右。通過體外抗氧化和細胞試驗表明WEP和FEP均具有較高的自由基清除能力，能提高氧化應激誘導的細胞存活率。通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)青刺果提取物也可以降低HSF內(nèi)ROS水平和提高過氧化氫酶活性和mRNA的表達水平以增強損傷細胞的總抗氧化能力，修復UVA誘導的氧化應激損傷。但與WEP相比，F(xiàn)EP的抗氧化能力以及對UVA誘導損傷的HSF的修復能力更為顯著。