王純，張若鴻，王曉芳，李曉然，楊洋，崔生輝，郭云昌

（1.河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100022）

近年來，因食源性致病菌污染食品供應(yīng)鏈，引發(fā)食品安全問題，造成食源性疾病頻繁發(fā)生，對其預(yù)防與控制已引起世界各國的高度關(guān)注。這些致病菌易受到各種環(huán)境因素（溫度、pH值、濕度、壓力、光照輻射、極端環(huán)境等）的影響，可能會暫時或永久地破壞細胞的主要結(jié)構(gòu)（細胞膜、核酸、蛋白質(zhì)等）而喪失功能，使其展現(xiàn)出不同的代謝狀態(tài)：亞致死狀態(tài)、活菌非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable-but-non-culturable，VBNC）或持留狀態(tài)和休眠[1]。因此，在食源性致病菌檢測過程中，某些代謝微弱的活菌無法被檢出，導(dǎo)致漏檢，致病菌仍然存在于食品中，從而威脅消費者健康。反之，如果死菌被檢測成活菌，則會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不僅阻礙食品的正常生產(chǎn)，還會造成不必要的產(chǎn)品召回，影響安全食品的供應(yīng)，而且干擾食品監(jiān)管部門對食品中致病菌的生長情況的正確判斷，不能及時發(fā)現(xiàn)食品安全隱患并有效控制食品安全風(fēng)險，對食品產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展造成嚴重危害。因此，如何區(qū)分死菌與活菌是有效檢測食源性致病菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提高活菌檢測的速度、效率和靈敏度對保障安全食品的供應(yīng)和預(yù)防食源性疾病尤為重要。

基于細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法耗時較長且無法有效區(qū)分處于不同代謝狀態(tài)的食品微生物[2]。為克服細胞培養(yǎng)方法的局限性，人們提出了各種可替代的、更快速的非細胞培養(yǎng)方法來檢測區(qū)分食源性致病菌中的死菌或活菌。本文重點介紹了熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）檢測法及其它基于噬菌體的檢測方法，并討論了其在活體食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用及發(fā)展前景，以期為進一步探究食源性致病菌的代謝狀態(tài)，研發(fā)更加快速高效的檢測方法提供參考。

1 基于細胞培養(yǎng)的方法

傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法靈敏度較高，成本較低且操作簡單，易于使用，成為食源性致病菌檢測的“金標準”，因此該方法仍然是目前許多食品檢測實驗室的首選方法。但是傳統(tǒng)的致病菌檢測過程相對比較繁瑣，需要經(jīng)過多步完成，如前增菌、選擇性增菌、分離純化、鏡檢，然后生化鑒定，整個培養(yǎng)時間較長，最多可能需要7 d的時間才能得出檢測結(jié)果[3]，不能滿足市場快速準確測定結(jié)果的要求。

此外，由于食品基質(zhì)的異質(zhì)性，病原體分布不均勻以及食物中目標病原體的含量低等原因可能會干擾選擇性鑒定，影響結(jié)果的準確性，限制檢測方法的靈敏度[4]。如果在被檢測的食品中存在處于受損狀態(tài)、VBNC狀態(tài)或休眠狀態(tài)的微生物，基于細胞培養(yǎng)方法的檢測能力可能會受到很大限制，不能有效區(qū)分死菌或活菌，造成病原菌感染擴散，成為食品安全的潛在隱患，對人類健康造成嚴重威脅。

2 非細胞培養(yǎng)的方法

非細胞培養(yǎng)方法本質(zhì)上分為兩種，即基于核酸和基于噬菌體的檢測方法，它們在檢測食源性致病菌活菌方面具有廣闊的應(yīng)用空間。

2.1 基于核酸的方法

以核酸為基礎(chǔ)的方法是通過檢測特定的DNA或RNA序列來鑒定食源性致病菌。盡管常規(guī)及定量PCR檢測方法等具有特異性強、靈敏度高和檢測快速等特點，但由于無法區(qū)分是來自活菌還是死菌的DNA或RNA，難以消除死菌殘留DNA導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，因此單獨使用無法證明細胞活性[5]。

2.1.1 qPCR檢測法

疊氮溴化乙錠（ethidiummonoazide，EMA）或疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）染料是插入型熒光核酸結(jié)合染料。EMA（10 μg/mL）[6]或 PMA（4 μg/mL）[7]在強光下可選擇性地透過受損的細胞膜與DNA發(fā)生不可逆的共價交聯(lián)反應(yīng)，從而抑制PCR擴增，最終只有來自細胞膜完整的細胞DNA才會被擴增[8]。

ZHOU等[9]將PMA作為前處理手段，結(jié)合qPCR，用于檢測牛奶中的活蠟狀芽孢桿菌。選擇催產(chǎn)芽孢桿菌的蠟狀內(nèi)酯合成酶基因作為引物，并利用3 μg/mL的PMA處理，以抑制死細胞DNA的PCR擴增。在優(yōu)化的測定參數(shù)下，以純培養(yǎng)物和加標牛奶為基質(zhì)，測得活菌的檢出限（limitofdetection，LOD）均為 102CFU/mL。值得關(guān)注的是，EMA/PMA可能在細菌細胞壁合成期間的某個時刻穿孔，抑制DNA擴增導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而且細胞膜保持完整狀態(tài)的細胞不一定具有代謝活性（如VBNC狀態(tài)的細胞），可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果[10]，無法對致病菌進行準確定量檢測，給食品安全帶來潛在的不可控風(fēng)險。此外，在檢測時需優(yōu)先使用PMA，因為EMA能夠穿透細胞膜完整的活細胞，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

2.1.2 mRNA檢測法

致病菌的DNA是穩(wěn)定的核酸分子，并且死菌的DNA降解較慢，因此細菌內(nèi)是否存在DNA不能作為判斷細菌是否存活的標志。而mRNA的半衰期較短，僅僅只有幾分鐘，在細菌死后很快降解，通常只存在于活細胞中，因此，測定RNA比DNA更適合作為評估細菌活力的靶標[11]。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）是最常用的基于RNA的分子技術(shù)之一，而且是快速檢測食品中食源性致病菌的首選方法。BAI等[12]基于磁性捕獲探針結(jié)合RT-qPCR的mRNA提取法快速檢測牛奶中活的沙門氏菌，其中探針和目標序列的復(fù)合體直接用作檢測沙門氏菌的模板，而無需變性和純化步驟。通過磁性捕獲探針來分離稀釋10倍的沙門氏菌人工污染的牛奶中的mRNA，然后利用RT-qPCR檢測mRNA，活菌的檢測靈敏度可達104CFU/mL，經(jīng)過12 h增菌培養(yǎng)后可以提高到10 CFU/mL。FOUT等[13]從水樣濃縮物中提取病毒的RNA，采用RT-qPCR定量測定飲用水中的腸病毒和諾如病毒的濃度，建立標準曲線，作為RT-qPCR的陽性對照，以每升病毒RNA的基因組拷貝數(shù)計算病毒濃度。在處理RNA樣品時應(yīng)需格外小心，以減少RNA的降解。

由于互補脫氧核苷酸（complementary DNA，cDNA）生成步驟需要更長的時間，且提取RNA比較復(fù)雜，因此RT-qPCR方法應(yīng)用于檢測食源性致病細菌不太常見。XIAO等[14]利用RT-qPCR方法檢測活的單核增生李斯特氏菌細胞，分別在未熱處理及經(jīng)過熱處理（98℃，30 min）的單核增生李斯特氏菌樣品中提取RNA進行RT-qPCR分析。熱處理的細胞在室溫（25℃）下保存24 h仍可以檢測到RT-qPCR擴增信號，并且信號強度與細胞數(shù)量相關(guān)，其結(jié)果與靶向RNA穩(wěn)定性有關(guān)。可見，不是所有的研究都證明mRNA壽命短，也可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；而且被測樣品中致病菌RNA易降解，也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，以mRNA為基礎(chǔ)的RT-PCR方法不能夠完全區(qū)分死菌或活菌，且檢測靈敏度受到mRNA提取不穩(wěn)定的限制。

2.2 基于噬菌體的方法

因噬菌體僅能高特異性地感染具有代謝活性的細菌，并且在活細胞內(nèi)復(fù)制，因此基于噬菌體的方法可以用來檢測細胞活性[15]。目前，大多數(shù)基于噬菌體的檢測方法均把裂解性噬菌體作為裂解劑來檢測新的子代噬菌體或根據(jù)目標細菌細胞內(nèi)釋放的物質(zhì)來區(qū)分細胞活性。

2.2.1 噬菌體擴增方法

將人工污染致病菌的食品樣品與特異性噬菌體一起培養(yǎng)，開始裂解循環(huán)，在潛伏期結(jié)束之前，用化學(xué)殺毒劑（含氯消毒劑、碘伏等）或物理處理（激光、高溫等）[16]殺死所有的外源性噬菌體。在受感染的細菌完成裂解循環(huán)后，釋放新的噬菌體顆粒，感染周圍的細菌，12 h培養(yǎng)后產(chǎn)生清除或斑塊的區(qū)域，如圖1所示。

圖1 噬菌體擴增（噬斑）試驗Fig.1 Phage amplification（plaque）test

由于噬菌體擴增操作簡單，具有較高的宿主特異性和較短的擴增時間，而且具有區(qū)分活菌和死菌細胞的能力，因此目前已被應(yīng)用于檢測不同的食源性致病菌，例如金黃色葡萄球菌[17]、沙門氏菌[18-19]、大腸桿菌[20]等。如ALCAINE等[20]建立了一種利用生物工程T7噬菌體菌株來提高基于噬菌體擴增的側(cè)向流動的方法檢測活菌。該方法在加標肉湯中測得活的大腸桿菌的檢出限為103CFU/mL。此外，該方法在加標河水中的檢出限為100 CFU/100 mL。然而，噬菌體擴增步驟較為繁雜，不適合高通量測試。如果不能完全殺死外源性噬菌體，可能留下假陽性斑塊。雖然可以通過PCR檢測來確定斑塊中心DNA的身份[21]，但可能會延長檢測時間。

2.2.2 噬菌體擴增+qPCR/免疫測定方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，研究發(fā)現(xiàn)免疫學(xué)[22]或分子檢測[23]與噬菌體擴增偶聯(lián)分別檢測子代噬菌體或噬菌體DNA，可以達到更快速的檢測時間，檢測原理如圖2所示。噬菌體擴增釋放出子代噬菌體，這些噬菌體可通過qPCR、酶聯(lián)免疫吸附測定或側(cè)流免疫層析方法進行定量檢測。

圖2 噬菌體擴增+qPCR/免疫學(xué)方法檢測致病菌活菌原理Fig.2 The principle of phage amplification+qPCR/immunological method to detect live pathogenic bacteria

目前，研究表明噬菌體擴增結(jié)合qPCR可以分別在8 h和2 h內(nèi)從不同的基質(zhì)（包括加標牛肉湯[23]和人工污染的水樣品[24]）中高度敏感地檢測出活的大腸桿菌O157：H7。將樣品進行增菌培養(yǎng)后，檢出限分別為10CFU/mL和100 CFU/mL。值得注意的是，噬菌體或宿主DNA要釋放到盡可能小的體積，才能最大限度地提高檢測靈敏度，否則可能需要進行DNA沉淀和柱提。

MIDO等[22]通過 LuminexMAGPIX儀器上的噬菌體MS2（一種大腸桿菌雄性特異性噬菌體）擴增偶聯(lián)免疫測定方法來檢測活的大腸桿菌。在大腸桿菌緩沖液中存在死細胞（95℃水浴加熱15 min）的情況下，MS2僅與活細胞選擇性結(jié)合，而且大腸桿菌增菌培養(yǎng)3 h之后測得活細胞的靈敏度為 1×102細胞/mL。MARTELET等[25]開發(fā)了一種高速靈敏的方法用于檢測食品基質(zhì)中活的大腸桿菌，該方法首先通過特異性噬菌體復(fù)制進行信號放大，然后進行免疫捕獲和靶向質(zhì)譜分析。該檢測細菌無需進行增菌培養(yǎng)，能夠在不到12 h的時間內(nèi)直接檢測到加標牛奶中含有1 CFU/mL活的大腸桿菌。該方法可以進一步改進，通過使用大量噬菌體來促進噬菌體宿主識別或使用免疫純化的抗體，可能會獲得更高的特異性和靈敏度。

2.2.3 噬菌體擴增+酶測定方法

在噬菌體裂解周期完成后，不僅釋放子代噬菌體，而且還釋放細胞的內(nèi)容物，包括必需的生物標志物[26]。樣品產(chǎn)生的生物發(fā)光與細胞內(nèi)化合物的釋放量和樣品中最初的活菌的細胞數(shù)量成正比，因此可以通過酶和底物反應(yīng)來測定化合物的釋放量。由于β-半乳糖苷酶（β-gal）是大腸桿菌乳糖運輸和代謝系統(tǒng)中的必需酶，可以用作檢測其活性的指標。因此CHEN等[27]通過監(jiān)測和測量β-gal活性，并進一步利用大腸桿菌特異性噬菌體進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌緩沖液中活菌的檢出限可達1×105CFU/mL，該檢測在3 h以內(nèi)完成。此外，基于熒光素酶[28]、蛋白酶[29]和堿性磷酸酶[30]的噬菌體檢測方法在測定食品樣品中的應(yīng)用更為廣泛。這些操作方法的測定原理基本相同，都是基于酶催化與發(fā)光產(chǎn)物的反應(yīng)。PACZESNY等[26]將攜帶磷酸酶基因phoA的大腸桿菌噬菌體T7添加到樣品中，如果樣品中存在活的大腸桿菌，則會發(fā)生噬菌體感染、復(fù)制和堿性磷酸酶表達，然后使用多種底物檢測堿性磷酸酶表達分子，原理如圖3所示。

圖3 噬菌體擴增+酶測定方法檢測原理Fig.3 Detection principle of phage amplification+enzyme assay method

2.2.4 電化學(xué)噬菌體生物傳感器

噬菌體作為一類特異性感染活細菌的病毒，具有較高的特異性和選擇性，而且能夠被快速、廉價的大量制備。近年來，利用電化學(xué)阻抗譜檢測食源性致病菌的研究越來越多。FAROOP等[31]開發(fā)了一種將從污水中分離出的金黃色葡萄球菌特異性噬菌體作為生物識別元件，固定于細菌纖維素為基質(zhì)的電化學(xué)生物傳感器，通過電流響應(yīng)可以有效區(qū)分細胞混合物中的活菌和死菌。該方法在中性pH值下，30 min以內(nèi)分別在磷酸鹽緩沖液和加標牛奶中檢測到低至3 CFU/mL和5 CFU/mL的活的金黃色葡萄球菌。NIYOMDECHA等[32]開發(fā)了一種基于沙門氏菌特異性M13噬菌體/金電極并結(jié)合電容技術(shù)的生物傳感器，其中M13噬菌體修飾的電極可以特異性結(jié)合活的沙門氏菌。該系統(tǒng)提供了良好的重現(xiàn)性，相對標準偏差為1.1%。此外，當以5倍稀釋度的加標雞肉樣品用于活的沙門氏菌檢測時，樣品進入傳感器系統(tǒng)后，該方法能夠在40 min內(nèi)測得沙門氏菌活菌200 CFU/mL的檢出限。可見，基于噬菌體的電化學(xué)生物傳感器在檢測食源性致病菌活菌方面具有較大的應(yīng)用潛力。

3 食源性致病菌活菌檢測方法存在的問題及展望

食源性致病菌活菌檢測技術(shù)在不斷進步，每種方法都有各自的優(yōu)勢，然而隨著技術(shù)的不斷進步，缺陷和不足也逐漸暴露出來。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法是評估病原體生存能力的“金標準”，但檢測速度較慢，而且也存在對持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌無法成功培養(yǎng)的缺陷。近年來，基于核酸的檢測方法可以提供較快的檢測速度，特別是基于mRNA的檢測方法，是一種潛在的快速檢測食源性致病菌活菌的解決方案。通常情況下，RT-qPCR方法檢測病毒的應(yīng)用較為普遍。然而，細菌mRNA易降解的特性阻礙了RT-qPCR在食品檢測中的大規(guī)模應(yīng)用。而基于噬菌體的檢測方法特異性強（100%），靈敏度高，且操作簡便、快速，已被廣泛應(yīng)用于食品、臨床等樣品致病菌活菌的檢測，基于噬菌體檢測方法的應(yīng)用見表1。該方法是目前檢測食源性致病菌活菌的最佳替代方法，在食源性致病菌活菌檢測領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。

由表1可知，噬菌體擴增+免疫測定與噬菌體擴增+qPCR方法相比，靈敏度略低。噬菌體擴增+qPCR方法可將裂解物直接用作目標噬菌體DNA，用于qPCR分析，而無需任何DNA提取和純化步驟，已應(yīng)用于不同基質(zhì)（食品和臨床樣品）中，能夠高度靈敏、快速地檢測不同的食源性致病菌活菌，而且在藥代動力學(xué)研究和噬菌體治療期間體內(nèi)噬菌體繁殖的評估方面具有潛在的應(yīng)用價值，相信未來在食源性致病菌活菌檢測領(lǐng)域?qū)⒌玫礁毡榈膽?yīng)用。目前，盡管噬菌體擴增+酶測定方法在食品中檢測致病菌活菌的應(yīng)用較少，但工程化噬菌體與特定蛋白酶結(jié)合可以實現(xiàn)對活菌病原體的多重檢測[29]，且易于在實驗室中使用，如沙門氏菌和李斯特氏菌[35]的特異性噬菌體已得到充分證明，這種噬菌體-蛋白酶-肽的組合將為樣品中活菌病原體的特異性、靈敏的多重檢測提供新的平臺。可見，噬菌體單獨使用或與酶（從酶抑制劑到磷酸酶）結(jié)合使用在食源性致病菌活菌檢測領(lǐng)域具有較好的發(fā)展?jié)摿??；谑删w的生物傳感器在食源性致病菌活菌檢測方面具有較高的特異性和靈敏度，并且檢測快速。然而，由于不同細菌對應(yīng)的特異性噬菌體不同或者某些細菌對噬菌體具有抗性，因此，在某些特殊情況下這種技術(shù)手段在有效區(qū)分細菌病原菌的活性方面還面臨挑戰(zhàn)，相關(guān)技術(shù)有待進一步深入研究。

表1 基于噬菌體檢測方法的應(yīng)用Table 1 Application based on phage detection methods

此外，目前基于噬菌體的檢測方法仍存在一些尚未解決的問題，例如自然界中不同的食源性致病菌可能不存在對應(yīng)的特異性噬菌體，無法有效檢測細菌活性。因此，隨著分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)的發(fā)展，有待進一步構(gòu)建新型噬菌體（對噬菌體進行基因工程改造）或重組噬菌體（構(gòu)建新型的酶標記的目標噬菌體），進而研究開發(fā)出靈敏度更高、更快速的低成本檢測方法，更好地應(yīng)用在一些特殊的細菌中，并進一步擴大基于噬菌體的檢測方法在實際樣品中的應(yīng)用范圍。基于噬菌體的檢測方法面臨的另一個重要挑戰(zhàn)是靶細胞的狀態(tài)。環(huán)境條件、溫度、細菌生長速率和細胞損傷等都是影響噬菌體感染成功和感染效率的重要因素[36]。受損細胞即為受到亞致死損傷的細胞，處理方法（加熱、冷凍、輻射、發(fā)酵等）所造成的損傷是可逆性損傷[37]。盡管不是所有的亞致死致病菌都能夠在常規(guī)增菌培養(yǎng)條件下修復(fù)，但目前研究比較多的食源性亞致死致病菌（包括沙門氏菌、大腸桿菌[38]、李斯特氏菌[39]等）在適當?shù)呐囵B(yǎng)溫度下（處理方式不同，所需的最優(yōu)溫度和修復(fù)時間不同），受損細胞在營養(yǎng)豐富的非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h～6 h就能得到修復(fù)并進行選擇性增殖以達到檢測所需的細菌濃度水平。一般對于大部分細菌來說，低溫條件下復(fù)蘇效果較好?？梢?，處于亞致死損傷狀態(tài)的致病菌在進行基于噬菌體的方法檢測之前，受損細胞需要經(jīng)過非選擇性修復(fù)培養(yǎng)（對損傷關(guān)鍵部位進行修復(fù)）后再進行選擇性增菌來確保細胞處于有利于感染的狀態(tài)，保證靶細胞的正常生長和成功檢測。若受損細胞無法正常修復(fù)增殖，則較常應(yīng)用于PCR的檢測方法[40]，而不適用于基于噬菌體的檢測方法。因此，細菌在檢測之前需要進行增菌培養(yǎng)，在適宜的增菌培養(yǎng)條件下以確保細胞處于有利于感染的狀態(tài)。在未來的研究中，無論是基于過濾還是基于噬菌體的磁珠分離[27]，在適當?shù)脑鼍囵B(yǎng)條件下進行細菌濃縮可以確保目標細菌達到必要的細胞濃度，進而加快食源性致病菌活菌的檢測速度，提高檢測靈敏度，對保障食品安全及開發(fā)食源性致病菌活菌的研究具有重要意義。

4 結(jié)論

本文對食源性致病菌活菌的檢測方法進行了分類與總結(jié)，介紹了其在食源性致病菌活菌檢測方面的應(yīng)用及其優(yōu)勢與存在的局限性，并對其面臨的機遇和挑戰(zhàn)進行了討論。綜上所述，基于噬菌體的檢測方法憑借特異性強、靈敏度高和檢測時間更短等優(yōu)勢，尤其是噬菌體擴增結(jié)合qPCR方法能夠快速檢測食源性致病菌的細胞活力，區(qū)分死菌/活菌，在食源性致病菌活菌檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，隨著人們不斷的深入研究，新型噬菌體的構(gòu)建及噬菌體擴增試驗與一些技術(shù)的交聯(lián)使用可以有效克服檢測中的缺陷，大大提高我國食源性致病菌的監(jiān)測和預(yù)警能力，以期能為相關(guān)研究者開發(fā)食源性致病菌活菌的檢測方法提供參考。