劉思佳，邢鈺彬，星萍，陳曉平

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

紫蘇（Perilla frutescens L.）是一年生草本植物，屬于唇形科（Labiatae）[1]，又被稱作赤蘇、香蘇等。紫蘇是一種藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物[2]，是我國(guó)最早公布的藥食同源植物之一[3]。據(jù)研究表明，紫蘇中的活性物質(zhì)有抗菌[4]、抗過(guò)敏、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抑菌防腐等功效。經(jīng)常食用紫蘇能起到降血脂、抗衰老、抗癌、提高記憶力、健腦等功能[7]。紫蘇的各個(gè)部位在食品行業(yè)都被廣泛應(yīng)用[8-9]。紫蘇葉作為優(yōu)質(zhì)食材深受消費(fèi)者喜愛。另外，市場(chǎng)上還有許多與紫蘇有關(guān)的產(chǎn)品，如紫蘇汁、紫蘇保健茶、紫蘇籽精油、紫蘇保健酒等[10-14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)紫蘇葉的研究也越來(lái)越多。由于紫蘇豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)紫蘇中化學(xué)成分及生物活性的研究已成為國(guó)內(nèi)外食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但我國(guó)對(duì)于紫蘇的研究起步較晚，大多集中在紫蘇黃酮提取工藝優(yōu)化方面，對(duì)紫蘇黃酮抗菌活性的研究甚少[15]。

本研究利用超聲波輔助乙醇提取法對(duì)紫蘇黃酮進(jìn)行提取。分別以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、霉菌及酵母菌（Saccharomycetes）為供試菌，采用濾紙片法等研究方法，通過(guò)抑菌圈、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）等指標(biāo)測(cè)定，探究紫蘇黃酮抗菌活性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究紫蘇黃酮抗菌活性的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，為紫蘇的開發(fā)利用和新型純天然食品保鮮劑的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫蘇：市售；蒸餾水：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鈣、鹽酸、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀：廣州化學(xué)試劑廠；植物蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂粉：上海緣肽生物技術(shù)有限公司；酵母提取物：山東玉寶生物科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：西亞化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌：豐暉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9037A）、電子天平（FA2004）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；粉碎機(jī)（SZFJ-200）：中國(guó)旭朗機(jī)械有限公司；超聲波提取儀（HJ911-8P）：上海達(dá)洛科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)（KH20R）：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV759/UV759CRT）：湖南聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；生化培養(yǎng)箱（BJPX-150）、高壓蒸汽滅菌鍋（BKQ-B100I）：山東博科科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R502B）：上海SENCO有限公司；循環(huán)水式真空泵（SHB-III型）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；普通型冷凍干燥機(jī)（LGJ-10）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；pH計(jì)（pH-9701）：北京格樂(lè)普高新技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇黃酮提取

將紫蘇葉放入鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行60℃恒溫干燥，干燥后將冷卻至37℃的紫蘇葉放入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后的紫蘇粉過(guò)80目篩，準(zhǔn)確稱取紫蘇干粉5.0 g，置于錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶劑，置于超聲波提取儀中進(jìn)行一定時(shí)間的提取、抽濾并收集濾渣，重復(fù)此步驟提取2次，合并濾液，放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，對(duì)其進(jìn)行減壓濃縮，將濃縮后的樣品用60%乙醇定容至100 mL，即得黃酮提取液，備用。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定

參考杜若源等[16]的方法稍作修改，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線詳見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.853 4x+0.525 1，R2=0.999 5。黃酮含量以每克干燥樣品中所含的相當(dāng)于蘆丁的量進(jìn)行計(jì)算[17]，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算紫蘇中黃酮的含量。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.4 紫蘇黃酮抗菌活性研究

1.4.1 菌種培養(yǎng)及菌懸液的制備

將活化好的4種供試菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌通過(guò)37℃恒溫培養(yǎng)24h待其活化。用接種環(huán)挑取少量供試菌于50mL的培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)24h，酵母菌在28℃下培養(yǎng)24 h，霉菌在30℃下培養(yǎng)48 h。分別取適量菌液用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，使菌懸液濃度達(dá)到108CFU/mL備用[18]。

1.4.2 抑菌圈試驗(yàn)

采用濾紙片法[19]，取濃度為108CFU/mL的各菌液1.0 mL分別加入到25 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，均勻混合后倒入平皿恒溫培養(yǎng)，以菌能夠長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿且能夠分布均勻?yàn)樵u(píng)判適宜菌液濃度標(biāo)準(zhǔn)。

1）利用打孔器，將滲透性強(qiáng)的濾紙片打孔，孔徑為8 mm左右，并將其放置于干凈的培養(yǎng)皿中，在121℃高溫高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后置無(wú)菌操作臺(tái)，備用。

2）設(shè)置不同濃度紫蘇黃酮提取液為試驗(yàn)組，分別為 2.5、5、10、15 mg/mL；設(shè)置濃度為 5 mg/mL 的山梨酸鉀作為陽(yáng)性對(duì)照組；以無(wú)菌水作空白對(duì)照組，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)操作。

3）在無(wú)菌操作臺(tái)中操作配制好的菌懸液，吸取100 μL搖勻后的菌懸液放在平板上，使用滅菌后的涂布棒將已經(jīng)冷卻凝固的固體培養(yǎng)基均勻涂布。每個(gè)培養(yǎng)基平皿設(shè)置無(wú)菌水為空白對(duì)照組（C）、設(shè)置5 mg/mL的山梨酸鉀為陽(yáng)性對(duì)照組（P）、試驗(yàn)組 1（T1，2.5mg/mL）、試驗(yàn)組 2（T2，5 mg/mL）、試驗(yàn)組 3（T3，10 mg/mL）、試驗(yàn)組4（T4，15 mg/mL）。將滅菌濾紙片用無(wú)菌鑷子放入到含有不同濃度黃酮提取液的滅菌培養(yǎng)皿中浸泡。用無(wú)菌鑷子夾取含黃酮的濾紙片，將多余液體在內(nèi)培養(yǎng)皿邊上擦掉，放置在含菌平板培養(yǎng)基表面，并進(jìn)行按壓，且不能破壞培養(yǎng)基，使濾紙片能與培養(yǎng)基進(jìn)行密切接觸。濾紙片距培養(yǎng)皿邊緣10 mm。每個(gè)培養(yǎng)皿均勻放置6張紙片。

4）將處理好的細(xì)菌平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)24 h～48 h后取出，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，測(cè)量3次取平均值。

1.4.3 MIC測(cè)定

采用曹銘晨等[20]方法，略作修改。采用倍比稀釋法，取試管分別編號(hào)1號(hào)～8號(hào)，1號(hào)管裝1.8 mL液體培養(yǎng)基，2號(hào)～8號(hào)管分別裝入1 mL液體培養(yǎng)基。通過(guò)高溫高壓滅菌后冷卻，在無(wú)菌臺(tái)上操作，分別加入0.2 mL濃度為1 mg/mL紫蘇黃酮溶液子1號(hào)管中，搖勻，從1號(hào)試管吸取1 mL混合液移入2號(hào)管，按這種方式依次進(jìn)行操作。1號(hào)～7號(hào)管中紫蘇提取物濃度分別為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 mg/mL。到 8號(hào)管棄去1 mL，用8號(hào)管作為對(duì)照組。再在1號(hào)～8號(hào)試管各加入菌懸液0.1 mL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察試管混濁還是澄清，澄清試驗(yàn)管的最低濃度為紫蘇黃酮對(duì)該菌的MIC值。

1.4.4 MBC測(cè)定

將紫蘇黃酮提取液的濃度大于等于MIC的試管繼續(xù)進(jìn)行為期24 h的培養(yǎng)，并觀察其生長(zhǎng)的情況，以依舊沒(méi)有菌生長(zhǎng)的黃酮提取液濃度為其MBC值[21]。

1.4.5 pH值對(duì)紫蘇黃酮抗菌活性的影響

按照程道梅等[22]方法稍作修改。用檸檬酸溶液（0.1 mol/L）和NaOH溶液（2%）分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使其 pH 值分別為 3、4、5、6、7、8。然后利用各菌的 MIC的黃酮提取液分別進(jìn)行抗菌性試驗(yàn)，以對(duì)照組乙醇進(jìn)行對(duì)比，研究pH值對(duì)紫蘇黃酮抗菌活性的影響。

1.4.6 紫蘇黃酮抗菌活性熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將黃酮提取液置于80、100、121℃的條件下分別處理15 min后，以對(duì)各菌的MIC的黃酮進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，探究紫蘇黃酮抗菌活性成分的熱穩(wěn)定性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)分別進(jìn)行3次，詳細(xì)記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)；利用SPSS軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，對(duì)紫蘇黃酮的抗菌性進(jìn)行基礎(chǔ)研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇黃酮對(duì)各供試菌抑菌活性的抑菌圈測(cè)定

紫蘇黃酮對(duì)各供試菌抑菌活性的抑菌圈測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 紫蘇黃酮對(duì)各供試菌的抑菌活性的抑菌圈測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of the bacteriostatic circle of perilla flavone on the bacteriostatic activities of each tested bacteria

由表1可知，不同濃度的紫蘇黃酮對(duì)4種供試菌均有一定的抑菌效果，隨著濃度的增加其抑菌效果也有明顯的增長(zhǎng)，這是因?yàn)樽咸K中的活性成分有效抑制了各類菌種的生長(zhǎng)。在相同濃度下，紫蘇對(duì)大腸桿菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他3種供試菌，其抑菌效果排列順序?yàn)榇竽c桿菌＞金黃色葡萄球菌＞酵母菌＞霉菌。對(duì)照組山梨酸鉀對(duì)各供試菌種也有一定抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果要明顯小于革蘭氏陰性菌，所以對(duì)霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌有良好的抑制作用；其主要是將微生物的脫氫酶系統(tǒng)進(jìn)行抑制，從而達(dá)到抗微生物以及防腐作用。

抑菌活性能力的結(jié)果表明，紫蘇黃酮對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌能力要強(qiáng)于革蘭氏陽(yáng)性菌，可能是這兩種細(xì)胞膜的組成與排列方式不同導(dǎo)致的。革蘭氏陰性菌的外部磷脂膜帶有結(jié)構(gòu)性脂多糖，它與孔蛋白構(gòu)成選擇性屏障，使得抑菌物質(zhì)滲透完全，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜外部有一個(gè)肽聚糖層，是無(wú)效的滲透屏障，從而抑菌作用沒(méi)有那么明顯[23]。研究表明，黃酮分子上有很多酚羥基，這些基團(tuán)能夠與蛋白質(zhì)或酶以氫鍵的方式結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)使其變性失活，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)固縮、解體，從而起到抑菌作用[24]。

2.2 紫蘇黃酮對(duì)各供試菌的MIC及MBC測(cè)定

紫蘇黃酮對(duì)各供試菌的最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 紫蘇黃酮對(duì)各供試菌的最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of minimal inhibitory concentration of perilla flavone on each strain tested

紫蘇黃酮對(duì)各供試菌的最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 紫蘇黃酮的最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of flavonoids from perilla flavone

由表2可知，在提取物濃度為0.625 mg/mL時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)完全被抑制；在提取物濃度為1.25 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)完全被抑制，提取液濃度為2.5 mg/mL時(shí)，酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)完全被抑制，而對(duì)照組中各菌生長(zhǎng)均呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。因此，紫蘇提取液對(duì)大腸桿菌的MIC為0.625 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 mg/mL，對(duì)酵母菌和霉菌的MIC均為2.5 mg/mL。

2.3 紫蘇黃酮抑菌活性的pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)

紫蘇黃酮抑菌活性的pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，在pH值為3～7的范圍內(nèi)，在紫蘇黃酮溶液濃度為0.625 mg/mL時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)完全被抑制；在黃酮溶液濃度為1.25 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)完全被抑制，濃度為2.5 mg/mL時(shí)，霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)完全被抑制，當(dāng)pH值上升至8時(shí)，紫蘇黃酮的抑制活性逐漸減弱，微生物生長(zhǎng)加快，但生長(zhǎng)趨勢(shì)小于對(duì)照組。未添加紫蘇黃酮的空白組在pH值小于5時(shí)，對(duì)各菌的生長(zhǎng)抑制性較強(qiáng)，但當(dāng)pH值大于7時(shí)，對(duì)各菌的生長(zhǎng)抑制強(qiáng)度降低。

表4 pH值對(duì)紫蘇黃酮抗菌活性的影響Table 4 Effect of pH on the antibacterial activity of perilla flavone

2.4 紫蘇黃酮抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

紫蘇黃酮抑菌活性的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 熱處理對(duì)紫蘇黃酮抗菌活性的影響Table 5 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of perilla flavone

由表5可知，溫度設(shè)定為80℃以下時(shí)，紫蘇提取物黃酮的抗菌活性未受到影響，均呈較為穩(wěn)定的抗菌性。設(shè)定溫度為100℃，加熱15 min，紫蘇黃酮的抗菌活性仍不受影響，設(shè)定溫度為121℃，15 min時(shí)，高溫處理會(huì)使其抗菌活性減弱，這是由于受高溫的影響，黃酮中的活性成分發(fā)生分解或改性。故控制溫度條件在100℃以下，對(duì)試驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生較大影響。

3 討論與結(jié)論

植物源抗菌物質(zhì)在自然界中廣泛存在，植物體內(nèi)的許多代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮類、有機(jī)酸類和酚類化合物等存在抑菌性[25]，而植物源黃酮類物質(zhì)具有廣譜抑菌性。本試驗(yàn)研究了紫蘇提取物黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌及酵母菌的抗菌作用，結(jié)果顯示：紫蘇提取物黃酮對(duì)這4種供試菌均有一定的抑菌效果，其對(duì)大腸桿菌抑菌效果最好，其次為金黃色葡萄球菌，再次為酵母菌和霉菌。

作為常用酸性防腐保鮮劑的苯甲酸、山梨酸只有在酸性條件下其防腐效果才能達(dá)到優(yōu)秀。本研究結(jié)果顯示在pH值為3～7的范圍內(nèi)，紫蘇黃酮均能對(duì)微生物的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出較好抑制作用，可見其pH值范圍較廣，對(duì)酸、弱堿性食品均可起到一定的保藏效果。

目前已從紫蘇總黃酮中分離出許多單體成分，如迷迭香酸、檸檬酸、黃芩苷芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、丹參素、咖啡酸、原兒茶酸。本研究為紫蘇黃酮抗菌作用的深入研究，為天然植物保鮮劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，促進(jìn)紫蘇黃酮資源更加合理利用。

熱處理作為食品加工儲(chǔ)藏的有效方法之一，使得保鮮防腐劑要發(fā)揮其抗菌作用必須具有一定的耐熱性。本研究結(jié)果顯示，紫蘇黃酮熱穩(wěn)定性較好，100℃加熱15 min抗菌活性未受影響。

本研究結(jié)果表明，紫蘇黃酮對(duì)4種供試菌均有一定的抗菌效果，其對(duì)大腸桿菌的抗菌活性最強(qiáng)（MIC，MBC分別為0.625、1.3mg/mL），其次為金黃色葡萄球菌（1.25、2.5 mg/mL），再次為酵母菌（MIC，MBC 分別為 2.5、4.8 mg/mL）和霉菌（MIC，MBC 分別為 2.5、5 mg/mL）。在pH值為3～7的范圍內(nèi)，提取液濃度在各菌的MIC濃度下，均能完全抑制受試微生物的生長(zhǎng)；溫度條件在100℃以下時(shí)，紫蘇黃酮的抗菌能力不受影響，當(dāng)溫度上升至121℃及以上時(shí)，會(huì)對(duì)抗菌活性有顯著影響。綜上所述，紫蘇作為一種天然優(yōu)質(zhì)抗菌植物資源可以加以研究開發(fā)利用。