孟迪，江威，郝之奎，廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000；3.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，浙江 臺(tái)州 318000）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是第一批通過(guò)美國(guó)食品和藥物管理局安全認(rèn)證的菌株，也是國(guó)內(nèi)微生物肥料使用的免檢菌株[1]。解淀粉芽孢桿菌屬革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌，具有抗逆性強(qiáng)，能夠分泌功能多樣的代謝產(chǎn)物，如淀粉酶、蛋白酶、磷酸酯酶、脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)以及一些具有免疫、抗氧化作用的活性物質(zhì)等，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2-4]。

堿性磷酸酯酶屬于水解酶類(lèi)，能夠催化含磷酯鍵的化合物水解，同時(shí)釋放出磷酸基團(tuán)及相應(yīng)的配基。此外，堿性磷酸酯酶也是一種非特異性酶，廣泛存在于幾乎所有的生物體內(nèi)[5]。目前已知的原核生物堿性磷酸酯酶可分為3個(gè)家族，即PhoA家族、PhoD家族和PhoX家族，其中海洋和土壤細(xì)菌中含有的PhoD酶比另外兩類(lèi)酶更為豐富[6]，盡管如此，PhoD家族的酶卻是這3大家族中表征最不清晰的。PhoD家族的典型代表是來(lái)源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的PhoD酶，而且該酶在Ca2+存在的條件下才具有活性[7]；另外一種已表征的PhoD家族成員是來(lái)源于枯草芽孢桿菌新型PhoD酶，該酶結(jié)構(gòu)中含有與1個(gè)Fe3+和2個(gè)Ca2+結(jié)合的活性位點(diǎn)[8]；第3種已表征的PhoD酶是來(lái)源于褐色鏈霉菌（Streptomyces chromofuscus）的分泌磷脂酶D，該酶不僅包含有1個(gè)鐵原子和亞化學(xué)計(jì)量的錳，它還需要Ca2+激活[9]。此外，PhoD酶是獨(dú)立于PhoA或PhoX家族的酶，該酶與真核紫色酸性磷酸酶（其金屬離子結(jié)合的活性位點(diǎn)：1個(gè)Fe3+和1個(gè)二價(jià)金屬離子，如 Fe2+、Mn2+或 Zn2+）有較高的相似性[8]。堿性磷酸酯酶尤其是PhoD家族的酶因其具有普遍存在性，使其成為一種很好的生物標(biāo)記，廣泛地應(yīng)用在農(nóng)業(yè)[10-11]、環(huán)境[11]、食品[12]、醫(yī)藥[6]等領(lǐng)域；另外，越來(lái)越多的PhoD酶作為特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)輔助生產(chǎn)β-半乳糖苷酶[13]、植酸酶[14]等；因此發(fā)掘新的PhoD酶不僅有助于擴(kuò)充PhoD家族成員，而且為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供參考。

本研究前期篩選出的菌株解淀粉芽孢桿菌YP6不僅具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力[15-16]，還能夠高效降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥[17-18]；而且已完成該菌株的全基因組測(cè)序，獲得的GenBank登錄號(hào)為CP032146[15]。通過(guò)分析該菌的全基因組發(fā)現(xiàn)，該菌基因組中僅含有3個(gè)注釋為堿性磷酸酯酶的基因，分別編碼屬于Flg和原噬菌體、PhoD和PhoA家族的酶（分別命名為AP1、AP2和AP3）。前期已對(duì)AP3的生物學(xué)功能進(jìn)行了詳細(xì)的研究[17]。盡管AP1被注釋為堿性磷酸酯酶，但該酶主要作用于鞭毛特異性肽聚糖的水解和前噬菌體尾部的形成。因此，本研究?jī)H對(duì)編碼AP2的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以其為模板進(jìn)行克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的研究，為AP2的功能研究以及進(jìn)一步地開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌YP6：江南大學(xué)生物催化與轉(zhuǎn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC NO：M 2018875）；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109 感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：江南大學(xué)生物催化與轉(zhuǎn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏；氨芐青霉素鈉（ampicillin，AMP）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)試劑盒、表達(dá)載體pColdII、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶（EcoR I和Sal I）和磷酸苯二鈉（disodium phenyl phosphate，DPP）：寶生物工程（大連）有限公司；對(duì)硝基磷酸苯二鈉（p-Nitrophenyl phosphate，pNPP）：美國(guó)Sigma公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2720型PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；JY92-IIN高壓細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；Smart View Pro 1100凝膠成像儀：美國(guó)Major Science公司；AKTA avant蛋白純化系統(tǒng)：美國(guó)通用公司；U-3310紫外分光光度計(jì)：日本日立公司；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；IS129FD-V1 pH計(jì)：上海儀邁儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0～7.2。

含氨芐的LB培養(yǎng)基：Amp終濃度為100 mg/L。

配制以上固體培養(yǎng)基需額外添加2%的瓊脂。上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

1.3.2.1 AP2編碼基因序列分析

使用 ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析編碼AP2的基因序列信息。

1.3.2.2 一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)使用在線服務(wù)器Ex-PASyProtParam Server（http：//web.expasy.org/protparam/）；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用NPS@在線服務(wù)器（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_go r4.html）；蛋白信號(hào)肽使用 SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預(yù)測(cè)。

1.3.2.3 多序列比對(duì)分析

使用 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)AP2的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，下載部分相似性高的序列，然后通過(guò)軟件CLUSTALW進(jìn)行多序列比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果用在線服務(wù)器ESPript（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）著色。所用分析序列均來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（除AP2外）。

1.3.2.4 保守結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI上的Conserved Domain Search Service，CD Search（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行查詢(xún)。

1.3.2.5 建樹(shù)分析

使用軟件MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 目的基因的克隆表達(dá)與蛋白純化

1.3.3.1 AP2編碼基因引物設(shè)計(jì)

本研究以解淀粉芽孢桿菌YP6全基因組中編碼AP2編碼的基因序列為模板來(lái)設(shè)計(jì)引物：AP2-F（5′-CCGGAATTCATGACACATGACGGCCGTT-3′）和 AP2-R（5′-ACGCGTCGACTTATTGTGAGATTTTGGCC CGTTTC-3′），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其中引物下劃線部分分別對(duì)應(yīng)EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)。

1.3.3.2 目標(biāo)基因的克隆表達(dá)及蛋白純化

參照張言周[19]研究中的克隆表達(dá)及蛋白純化方法進(jìn)行操作。

目標(biāo)基因的克隆表達(dá)：用于基因克隆的宿主菌為E.coli JM109，誘導(dǎo)表達(dá)的宿主菌為 E.coli BL21（DE3）；誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照為空載BL21-pColdⅡ（Bp）；粗酶液使用對(duì)硝基苯基磷酸二鈉（p-nitrophenolphosphate，pNPP）比色法[20]進(jìn)行酶活檢測(cè)，并用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行驗(yàn)證。

蛋白純化：親和層析鎳柱選用5 mLHisTrap HP，結(jié)合液為0.5 mol/L NaCl和含5 mmol/L咪唑的Na2HPO4-NaH2PO4溶液；洗脫液與結(jié)合液類(lèi)似，但將咪唑的濃度變?yōu)楹?00 mmol/L咪唑的Na2HPO4-NaH2PO4溶液。

蛋白脫鹽：收集的洗脫液經(jīng)脫鹽柱（5 mL HiTrap TM）脫鹽，緩沖液為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4溶液。

重懸菌體，配制結(jié)合液、洗脫液以及脫鹽過(guò)程所用的緩沖液均為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4溶液，pH7.4。

1.3.3.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

從pH值、溫度、穩(wěn)定性、金屬離子及抑制劑等方面對(duì)AP2的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，此外，還對(duì)其Km和kcat值進(jìn)行測(cè)定。具體操作如下：30℃條件下，測(cè)定不同pH值（3.0～12.0）對(duì)酶活性的影響，其中相對(duì)酶活以最大酶活的百分比表示。將反應(yīng)液于4℃～80℃下，測(cè)定不同溫度對(duì)酶活的影響，并計(jì)算相對(duì)酶活。將酶液分別置于不同pH值和溫度下1 h，測(cè)定重組酶在最適溫度和pH值條件下的穩(wěn)定性，其中初始酶活設(shè)置為100%。選取 10 種金屬離子 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Fe3+和 Ni2+，在最適條件下測(cè)定酶活力，以不添加金屬離子為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活。選取4種常見(jiàn)物質(zhì)（EDTA-2Na、L-絲氨酸、L-組氨酸和L-半胱氨酸）在最適條件下測(cè)定酶活力，以不添加上述物質(zhì)為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活。上述試驗(yàn)均以pNPP為底物。此外，在最適溫度和pH值下，酶液與不同濃度的底物（pNPP和DPP）反應(yīng)，采用Linewear-Burk雙倒數(shù)作圖法，分別求出AP2水解pNPP和DPP的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和kcat。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼AP2酶的基因序列分析

最大開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）分析結(jié)果顯示AP2酶的編碼基因大小為1 752 bp，且以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。該序列已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank登錄號(hào)為KY403890.1。

2.2 AP2氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

使用MEGA6.0對(duì)AP2與其它來(lái)源的堿性磷酸酯酶的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 AP2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic trees of the amino acid sequence of AP2

由圖1可知，AP2聚類(lèi)到堿性磷酸酯酶PhoD家族，且與解淀粉芽孢桿菌來(lái)源的堿性磷酸酯酶（登錄號(hào)：AEB22432.1）序列相似度最高。

2.3 AP2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

AP2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果如表1所示。由表1可知，AP2的pI值為8.62，屬堿性蛋白，且蛋白結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、親水性高。

表1 AP2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)Table 1 Prediction and statistics of primary and secondary structure of AP2

2.4 AP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

AP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 AP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)Table 2 Prediction and statistics of secondary structure of AP2

由表2可知，AP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中只含有α-螺旋（36.88%）、β-折疊（15.95%）和無(wú)規(guī)則卷曲（47.17%）。此外，利用在線分析工具Signal IP5.0對(duì)AP2蛋白序列的信號(hào)肽進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 AP2蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Signal peptide prediction of AP2

由圖2可知，AP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在Tat/SPI信號(hào)肽，且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第56和57號(hào)氨基酸（VNA-AP）之間。

2.5 AP2保守結(jié)構(gòu)域分析和多序列比對(duì)

AP2蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域查詢(xún)結(jié)果如圖3所示。

圖3 AP2與其它來(lái)源的PhoD酶氨基酸序列比對(duì)分析Fig.3 Amino acid sequence alignment of AP2 and other PhoDs

由圖3可知，AP2蛋白序列中只含有堿性磷酸酯酶PhoD超家族（位于22位～540位氨基酸殘基），該結(jié)果與圖1進(jìn)化樹(shù)中顯示的結(jié)果一致。進(jìn)一步將AP2與兩種已表征的PhoD酶 [分別為來(lái)源于Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和色褐鏈霉菌（Streptomyces chromofuscus）]的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖 3b），發(fā)現(xiàn)AP2中含有與Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168來(lái)源的PhoD酶（PDB：2yeq.1）完全一致的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)；而與色褐鏈霉菌來(lái)源的PhoD酶（AF523823.1）相比，除AP2中272位與CaB結(jié)合的氨基酸殘基不同外，其余的金屬結(jié)合位點(diǎn)均相同。

2.6 編碼AP2基因的分子克隆及異源表達(dá)

將編碼AP2蛋白的基因ap2連接到載體pColdII上，得到的重組質(zhì)粒pColdII-ap2。將重組質(zhì)粒pColdII-ap2轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，之后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提以及雙酶切驗(yàn)證，雙酶切結(jié)果如圖4所示。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pColdII-ap2轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，然后挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 重組質(zhì)粒pColdII-ap2雙酶切結(jié)果Fig.4 Double digestion results of recombinant plasmid pColdII-ap2

圖5 重組菌E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2的菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.5 Results of PCR identification of recombinant E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2

由圖4、圖5可知，進(jìn)一步序列測(cè)定表明序列正確，表明 E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2 構(gòu)建成功。

對(duì)重組菌 E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2 誘導(dǎo)表達(dá)獲得的粗酶液、純化脫鹽后的純酶液進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 重組蛋白AP2的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant AP2

由圖6可知，重組酶成功表達(dá)，而且重組AP2的蛋白質(zhì)大小與推定的分子量大小（66 kDa）相當(dāng)。

2.7 AP2蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究

對(duì)AP2在不同溫度、pH值、金屬離子以及抑制劑下的酶活進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH值、溫度、金屬離子以及抑制劑對(duì)重組酶AP2活性的影響Fig.7 Effects of pH，temperature，metal irons and inhibitors on the activity of recombinant AP2

由圖7a可知，AP2的最適pH值為5.5，而且在pH 4.0～7.0范圍內(nèi)具有50%以上的酶活。由圖7b可知，AP2的最適反應(yīng)溫度為30℃；在低溫下，AP2保持著較高的酶活；而當(dāng)溫度高于40℃，其酶活性急劇下降；當(dāng)溫度在70℃～80℃的條件下，AP2的酶活幾乎檢測(cè)不到。由圖 7c可知，在金屬離子濃度（0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol/L） 變化過(guò)程中，Mn2+、Ba2+和 Co2+始終對(duì)AP2有激活作用，Mg2+對(duì)AP2有激活作用不明顯，F(xiàn)e2+和Fe3+始終對(duì)AP2有抑制作用，其它金屬離子（Ca2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+）在濃度變化過(guò)程中對(duì)AP2既有激活作用也有抑制作用。由圖7d可知，不同濃度（0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mmol/L） 的 EDTA-2Na、L-組氨酸、L-絲氨酸和L-半胱氨酸均能抑制AP2的活性，其中EDTA-2Na和L-半胱氨酸的抑制作用更為顯著。分別測(cè)定了AP2對(duì)底物DPP和pNPP的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，AP2對(duì)底物DPP的動(dòng)力學(xué)常數(shù)（kcat和kcat/Km）分別為4.0×105s和1.1×105L/（mmol·s），分別高于其對(duì)底物 pNPP 的 kcat值（2.3×105s）和 kcat/Km值[8.8×102L/（mmol·s）]；而 AP2 對(duì)底物 DPP 的 Km值（3.8mmol/L）低于其對(duì)底物pNPP的Km值（260.4 mmol/L），表明AP2對(duì)底物DPP的催化效率和親和性均高于對(duì)底物pNPP。

表3 AP2蛋白的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 The kinetic parameters of recombinant AP2

3 討論與結(jié)論

以解淀粉芽孢桿菌YP6基因組中編碼PhoD酶（AP2）的基因（KY403890.1）為模板，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的研究。發(fā)現(xiàn)AP2是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親水性高、有信號(hào)肽且屬于PhoD家族的酶；重組AP2酶的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為30℃和5.5；AP2的活性受金屬離子和抑制劑的影響較大，其中 Mn2+、Ba2+和 Co2+對(duì) AP2 有激活作用，而Fe2+、Fe3+、EDTA-2Na、L-組氨酸、L-絲氨酸和 L-半胱氨酸對(duì)AP2有抑制作用；AP2對(duì)底物DPP的催化效率和親和性均高于其對(duì)底物pNPP的催化效率和親和性。

PhoD酶是一類(lèi)重要的堿性磷酸酯酶[6]。通過(guò)對(duì)AP2氨基酸序列的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AP2聚類(lèi)到堿性磷酸酯酶的PhoD家族，并且具有PhoD家族功能結(jié)構(gòu)域以及與已表征的PhoD酶相同或相似的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。然而與其它堿性磷酸酯酶（包括已報(bào)道的PhoD酶）的最適pH（8.0～10.3）相比，AP2的最適pH為5.5；研究表明，PhoD酶與真核紫色酸性磷酸酶最相似[8]，因此，可推測(cè)AP2與其它的已報(bào)道的PhoD酶不同，與它們相比，AP2的生物學(xué)活性更接近于真核紫色酸性磷酸酶。

通常很多酶需要金屬離子來(lái)維持或提高自身穩(wěn)定性，或者通過(guò)金屬離子與除活性位點(diǎn)外的其它氨基酸附著點(diǎn)相結(jié)合來(lái)提高自身的活力[21]，因此外源金屬離子的添加會(huì)在一定程度上激活或抑制酶的活性。PhoD家族是一類(lèi)金屬依賴(lài)型堿性磷酸酯酶[8]。通過(guò)對(duì)AP2與已表征的PhoD酶的多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這類(lèi)酶需要鐵離子和鈣離子配合活性中心，然而金屬離子對(duì)酶活性影響的實(shí)驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)在金屬離子濃度變化的過(guò)程中，F(xiàn)e2+和Fe3+始終對(duì)AP2有抑制作用，Ca2+在濃度變化過(guò)程中對(duì)AP2既有激活作用也有抑制作用。