孟迪，江威，郝之奎，廖祥儒*

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.商丘師范學院 生物與食品學院，河南 商丘 476000；3.臺州職業(yè)技術學院 應用生物技術研究所，浙江 臺州 318000）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是第一批通過美國食品和藥物管理局安全認證的菌株，也是國內微生物肥料使用的免檢菌株[1]。解淀粉芽孢桿菌屬革蘭陽性芽孢桿菌，具有抗逆性強，能夠分泌功能多樣的代謝產物，如淀粉酶、蛋白酶、磷酸酯酶、脂肽類抗菌物質以及一些具有免疫、抗氧化作用的活性物質等，廣泛地應用于農業(yè)、食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領域[2-4]。

堿性磷酸酯酶屬于水解酶類，能夠催化含磷酯鍵的化合物水解，同時釋放出磷酸基團及相應的配基。此外，堿性磷酸酯酶也是一種非特異性酶，廣泛存在于幾乎所有的生物體內[5]。目前已知的原核生物堿性磷酸酯酶可分為3個家族，即PhoA家族、PhoD家族和PhoX家族，其中海洋和土壤細菌中含有的PhoD酶比另外兩類酶更為豐富[6]，盡管如此，PhoD家族的酶卻是這3大家族中表征最不清晰的。PhoD家族的典型代表是來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的PhoD酶，而且該酶在Ca2+存在的條件下才具有活性[7]；另外一種已表征的PhoD家族成員是來源于枯草芽孢桿菌新型PhoD酶，該酶結構中含有與1個Fe3+和2個Ca2+結合的活性位點[8]；第3種已表征的PhoD酶是來源于褐色鏈霉菌（Streptomyces chromofuscus）的分泌磷脂酶D，該酶不僅包含有1個鐵原子和亞化學計量的錳，它還需要Ca2+激活[9]。此外，PhoD酶是獨立于PhoA或PhoX家族的酶，該酶與真核紫色酸性磷酸酶（其金屬離子結合的活性位點：1個Fe3+和1個二價金屬離子，如 Fe2+、Mn2+或 Zn2+）有較高的相似性[8]。堿性磷酸酯酶尤其是PhoD家族的酶因其具有普遍存在性，使其成為一種很好的生物標記，廣泛地應用在農業(yè)[10-11]、環(huán)境[11]、食品[12]、醫(yī)藥[6]等領域；另外，越來越多的PhoD酶作為特異性轉運系統輔助生產β-半乳糖苷酶[13]、植酸酶[14]等；因此發(fā)掘新的PhoD酶不僅有助于擴充PhoD家族成員，而且為進一步研究其生物學功能提供參考。

本研究前期篩選出的菌株解淀粉芽孢桿菌YP6不僅具有促進植物生長的能力[15-16]，還能夠高效降解多種有機磷農藥[17-18]；而且已完成該菌株的全基因組測序，獲得的GenBank登錄號為CP032146[15]。通過分析該菌的全基因組發(fā)現，該菌基因組中僅含有3個注釋為堿性磷酸酯酶的基因，分別編碼屬于Flg和原噬菌體、PhoD和PhoA家族的酶（分別命名為AP1、AP2和AP3）。前期已對AP3的生物學功能進行了詳細的研究[17]。盡管AP1被注釋為堿性磷酸酯酶，但該酶主要作用于鞭毛特異性肽聚糖的水解和前噬菌體尾部的形成。因此，本研究僅對編碼AP2的基因進行生物信息學分析，以其為模板進行克隆表達和酶學性質的研究，為AP2的功能研究以及進一步地開發(fā)和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌YP6：江南大學生物催化與轉化生物學實驗室篩選并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號：CCTCC NO：M 2018875）；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109 感受態(tài)細胞、大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細胞：江南大學生物催化與轉化生物學實驗室保藏；氨芐青霉素鈉（ampicillin，AMP）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、細菌基因組提取試劑盒、DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應試劑盒、表達載體pColdII、T4 DNA連接酶、限制性內切酶（EcoR I和Sal I）和磷酸苯二鈉（disodium phenyl phosphate，DPP）：寶生物工程（大連）有限公司；對硝基磷酸苯二鈉（p-Nitrophenyl phosphate，pNPP）：美國Sigma公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

2720型PCR儀：美國應用生物系統公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JY92-IIN高壓細胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；Smart View Pro 1100凝膠成像儀：美國Major Science公司；AKTA avant蛋白純化系統：美國通用公司；U-3310紫外分光光度計：日本日立公司；Synergy H4多功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州中誠儀器制造有限公司；IS129FD-V1 pH計：上海儀邁儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0～7.2。

含氨芐的LB培養(yǎng)基：Amp終濃度為100 mg/L。

配制以上固體培養(yǎng)基需額外添加2%的瓊脂。上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.3.2 生物信息學分析

1.3.2.1 AP2編碼基因序列分析

使用 ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析編碼AP2的基因序列信息。

1.3.2.2 一級結構和二級結構預測

一級結構及理化性質預測使用在線服務器Ex-PASyProtParam Server（http：//web.expasy.org/protparam/）；二級結構預測使用NPS@在線服務器（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_go r4.html）；蛋白信號肽使用 SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預測。

1.3.2.3 多序列比對分析

使用 NCBI數據庫（http：//www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對AP2的氨基酸序列進行比對，下載部分相似性高的序列，然后通過軟件CLUSTALW進行多序列比對，并將比對結果用在線服務器ESPript（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）著色。所用分析序列均來自GenBank數據庫（除AP2外）。

1.3.2.4 保守結構域分析

使用NCBI上的Conserved Domain Search Service，CD Search（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對蛋白保守結構域進行查詢。

1.3.2.5 建樹分析

使用軟件MEGA6.0構建系統進化樹。

1.3.3 目的基因的克隆表達與蛋白純化

1.3.3.1 AP2編碼基因引物設計

本研究以解淀粉芽孢桿菌YP6全基因組中編碼AP2編碼的基因序列為模板來設計引物：AP2-F（5′-CCGGAATTCATGACACATGACGGCCGTT-3′）和 AP2-R（5′-ACGCGTCGACTTATTGTGAGATTTTGGCC CGTTTC-3′），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；其中引物下劃線部分分別對應EcoR I和Sal I酶切位點。

1.3.3.2 目標基因的克隆表達及蛋白純化

參照張言周[19]研究中的克隆表達及蛋白純化方法進行操作。

目標基因的克隆表達：用于基因克隆的宿主菌為E.coli JM109，誘導表達的宿主菌為 E.coli BL21（DE3）；誘導表達的對照為空載BL21-pColdⅡ（Bp）；粗酶液使用對硝基苯基磷酸二鈉（p-nitrophenolphosphate，pNPP）比色法[20]進行酶活檢測，并用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進行驗證。

蛋白純化：親和層析鎳柱選用5 mLHisTrap HP，結合液為0.5 mol/L NaCl和含5 mmol/L咪唑的Na2HPO4-NaH2PO4溶液；洗脫液與結合液類似，但將咪唑的濃度變?yōu)楹?00 mmol/L咪唑的Na2HPO4-NaH2PO4溶液。

蛋白脫鹽：收集的洗脫液經脫鹽柱（5 mL HiTrap TM）脫鹽，緩沖液為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4溶液。

重懸菌體，配制結合液、洗脫液以及脫鹽過程所用的緩沖液均為20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4溶液，pH7.4。

1.3.3.3 酶學性質分析

從pH值、溫度、穩(wěn)定性、金屬離子及抑制劑等方面對AP2的酶學性質進行研究，此外，還對其Km和kcat值進行測定。具體操作如下：30℃條件下，測定不同pH值（3.0～12.0）對酶活性的影響，其中相對酶活以最大酶活的百分比表示。將反應液于4℃～80℃下，測定不同溫度對酶活的影響，并計算相對酶活。將酶液分別置于不同pH值和溫度下1 h，測定重組酶在最適溫度和pH值條件下的穩(wěn)定性，其中初始酶活設置為100%。選取 10 種金屬離子 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Fe3+和 Ni2+，在最適條件下測定酶活力，以不添加金屬離子為對照，計算相對酶活。選取4種常見物質（EDTA-2Na、L-絲氨酸、L-組氨酸和L-半胱氨酸）在最適條件下測定酶活力，以不添加上述物質為對照，計算相對酶活。上述試驗均以pNPP為底物。此外，在最適溫度和pH值下，酶液與不同濃度的底物（pNPP和DPP）反應，采用Linewear-Burk雙倒數作圖法，分別求出AP2水解pNPP和DPP的動力學常數Km和kcat。

2 結果與分析

2.1 編碼AP2酶的基因序列分析

最大開放閱讀框（open reading frame，ORF）分析結果顯示AP2酶的編碼基因大小為1 752 bp，且以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。該序列已提交至NCBI數據庫，GenBank登錄號為KY403890.1。

2.2 AP2氨基酸序列系統發(fā)育樹

使用MEGA6.0對AP2與其它來源的堿性磷酸酯酶的氨基酸序列構建系統發(fā)育樹，結果見圖1。

圖1 AP2氨基酸序列的系統發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of the amino acid sequence of AP2

由圖1可知，AP2聚類到堿性磷酸酯酶PhoD家族，且與解淀粉芽孢桿菌來源的堿性磷酸酯酶（登錄號：AEB22432.1）序列相似度最高。

2.3 AP2蛋白一級結構的預測

AP2蛋白一級結構在線預測結果如表1所示。由表1可知，AP2的pI值為8.62，屬堿性蛋白，且蛋白結構較穩(wěn)定、親水性高。

表1 AP2蛋白一級結構預測統計Table 1 Prediction and statistics of primary and secondary structure of AP2

2.4 AP2蛋白二級結構的預測

AP2蛋白二級結構在線預測結果如表2所示。

表2 AP2蛋白二級結構預測統計Table 2 Prediction and statistics of secondary structure of AP2

由表2可知，AP2蛋白二級結構中只含有α-螺旋（36.88%）、β-折疊（15.95%）和無規(guī)則卷曲（47.17%）。此外，利用在線分析工具Signal IP5.0對AP2蛋白序列的信號肽進行了預測，結果如圖2所示。

圖2 AP2蛋白的信號肽預測結果Fig.2 Signal peptide prediction of AP2

由圖2可知，AP2蛋白二級結構中存在Tat/SPI信號肽，且信號肽的剪切位點位于第56和57號氨基酸（VNA-AP）之間。

2.5 AP2保守結構域分析和多序列比對

AP2蛋白氨基酸序列的保守結構域查詢結果如圖3所示。

圖3 AP2與其它來源的PhoD酶氨基酸序列比對分析Fig.3 Amino acid sequence alignment of AP2 and other PhoDs

由圖3可知，AP2蛋白序列中只含有堿性磷酸酯酶PhoD超家族（位于22位～540位氨基酸殘基），該結果與圖1進化樹中顯示的結果一致。進一步將AP2與兩種已表征的PhoD酶 [分別為來源于Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和色褐鏈霉菌（Streptomyces chromofuscus）]的氨基酸序列進行比對（圖 3b），發(fā)現AP2中含有與Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168來源的PhoD酶（PDB：2yeq.1）完全一致的金屬離子結合位點；而與色褐鏈霉菌來源的PhoD酶（AF523823.1）相比，除AP2中272位與CaB結合的氨基酸殘基不同外，其余的金屬結合位點均相同。

2.6 編碼AP2基因的分子克隆及異源表達

將編碼AP2蛋白的基因ap2連接到載體pColdII上，得到的重組質粒pColdII-ap2。將重組質粒pColdII-ap2轉化E.coli JM109感受態(tài)細胞，之后挑取陽性克隆進行培養(yǎng)、質粒抽提以及雙酶切驗證，雙酶切結果如圖4所示。將驗證正確的重組質粒pColdII-ap2轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，然后挑取陽性轉化子進行單菌落PCR驗證，結果見圖5。

圖4 重組質粒pColdII-ap2雙酶切結果Fig.4 Double digestion results of recombinant plasmid pColdII-ap2

圖5 重組菌E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2的菌落PCR鑒定結果Fig.5 Results of PCR identification of recombinant E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2

由圖4、圖5可知，進一步序列測定表明序列正確，表明 E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2 構建成功。

對重組菌 E.coli BL21（DE3）-pColdII-ap2 誘導表達獲得的粗酶液、純化脫鹽后的純酶液進行SDSPAGE電泳檢測，結果如圖6所示。

圖6 重組蛋白AP2的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant AP2

由圖6可知，重組酶成功表達，而且重組AP2的蛋白質大小與推定的分子量大小（66 kDa）相當。

2.7 AP2蛋白的酶學性質研究

對AP2在不同溫度、pH值、金屬離子以及抑制劑下的酶活進行了測定，結果如圖7所示。

圖7 pH值、溫度、金屬離子以及抑制劑對重組酶AP2活性的影響Fig.7 Effects of pH，temperature，metal irons and inhibitors on the activity of recombinant AP2

由圖7a可知，AP2的最適pH值為5.5，而且在pH 4.0～7.0范圍內具有50%以上的酶活。由圖7b可知，AP2的最適反應溫度為30℃；在低溫下，AP2保持著較高的酶活；而當溫度高于40℃，其酶活性急劇下降；當溫度在70℃～80℃的條件下，AP2的酶活幾乎檢測不到。由圖 7c可知，在金屬離子濃度（0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol/L） 變化過程中，Mn2+、Ba2+和 Co2+始終對AP2有激活作用，Mg2+對AP2有激活作用不明顯，Fe2+和Fe3+始終對AP2有抑制作用，其它金屬離子（Ca2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+）在濃度變化過程中對AP2既有激活作用也有抑制作用。由圖7d可知，不同濃度（0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mmol/L） 的 EDTA-2Na、L-組氨酸、L-絲氨酸和L-半胱氨酸均能抑制AP2的活性，其中EDTA-2Na和L-半胱氨酸的抑制作用更為顯著。分別測定了AP2對底物DPP和pNPP的動力學常數，結果見表3。

由表3可知，AP2對底物DPP的動力學常數（kcat和kcat/Km）分別為4.0×105s和1.1×105L/（mmol·s），分別高于其對底物 pNPP 的 kcat值（2.3×105s）和 kcat/Km值[8.8×102L/（mmol·s）]；而 AP2 對底物 DPP 的 Km值（3.8mmol/L）低于其對底物pNPP的Km值（260.4 mmol/L），表明AP2對底物DPP的催化效率和親和性均高于對底物pNPP。

表3 AP2蛋白的酶促動力學參數Table 3 The kinetic parameters of recombinant AP2

3 討論與結論

以解淀粉芽孢桿菌YP6基因組中編碼PhoD酶（AP2）的基因（KY403890.1）為模板，對其進行生物信息學分析、異源表達和酶學性質的研究。發(fā)現AP2是一種結構穩(wěn)定、親水性高、有信號肽且屬于PhoD家族的酶；重組AP2酶的最適反應溫度和pH值分別為30℃和5.5；AP2的活性受金屬離子和抑制劑的影響較大，其中 Mn2+、Ba2+和 Co2+對 AP2 有激活作用，而Fe2+、Fe3+、EDTA-2Na、L-組氨酸、L-絲氨酸和 L-半胱氨酸對AP2有抑制作用；AP2對底物DPP的催化效率和親和性均高于其對底物pNPP的催化效率和親和性。

PhoD酶是一類重要的堿性磷酸酯酶[6]。通過對AP2氨基酸序列的生物信息學分析，發(fā)現AP2聚類到堿性磷酸酯酶的PhoD家族，并且具有PhoD家族功能結構域以及與已表征的PhoD酶相同或相似的金屬離子結合位點。然而與其它堿性磷酸酯酶（包括已報道的PhoD酶）的最適pH（8.0～10.3）相比，AP2的最適pH為5.5；研究表明，PhoD酶與真核紫色酸性磷酸酶最相似[8]，因此，可推測AP2與其它的已報道的PhoD酶不同，與它們相比，AP2的生物學活性更接近于真核紫色酸性磷酸酶。

通常很多酶需要金屬離子來維持或提高自身穩(wěn)定性，或者通過金屬離子與除活性位點外的其它氨基酸附著點相結合來提高自身的活力[21]，因此外源金屬離子的添加會在一定程度上激活或抑制酶的活性。PhoD家族是一類金屬依賴型堿性磷酸酯酶[8]。通過對AP2與已表征的PhoD酶的多序列比對，發(fā)現這類酶需要鐵離子和鈣離子配合活性中心，然而金屬離子對酶活性影響的實驗中卻發(fā)現在金屬離子濃度變化的過程中，Fe2+和Fe3+始終對AP2有抑制作用，Ca2+在濃度變化過程中對AP2既有激活作用也有抑制作用。