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        紅豆越橘酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗氧化性能研究

        2021-12-21 10:17:00孫銀玲王偉明
        食品與藥品 2021年6期
        關(guān)鍵詞:越橘酵素白砂糖

        綦 菲,孫 妍,王 靜,孫銀玲,王偉明

        (黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150036)

        紅豆越橘為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)常綠小灌木的漿果,又名紅果、紅豆[1]。主產(chǎn)自我國(guó)黑龍江省大興安嶺地區(qū),具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。紅豆越橘果實(shí)中富含有機(jī)酸、多種維生素、微量元素及黃酮、原花青素、超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分[2]。紅豆越橘果實(shí)中已檢出24種氨基酸,28種酚類化合物[3]。研究發(fā)現(xiàn),紅豆越橘具有抗氧化、抗菌消炎、抗糖尿病、改善心腦血管疾病等功效[4-5]。紅豆越橘的價(jià)值也逐漸受到人們廣泛關(guān)注,但由于深度開(kāi)發(fā)力度不夠,僅停留在產(chǎn)品粗加工階段,大多是紅豆越橘原漿、濃縮汁等形式。

        酵素是以蔬菜、水果、菌類等為原料,經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而制成的,富含多種維生素、礦物質(zhì)、生物酶等生物活性物質(zhì)的食品[6-7]。酵素具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力及維持菌群平衡等功能[8]。植物酵素在發(fā)酵過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)轉(zhuǎn)化,不僅保留了原有果實(shí)中的固有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還產(chǎn)生了新的活性成分。本文對(duì)紅豆越橘酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究,并對(duì)其SOD酶活力及清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性進(jìn)行測(cè)定,為紅豆越橘酵素的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Lambda 365紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer);DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱,電熱恒溫水浴鍋(上海一恒);LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安);電子分析天平(賽多利斯);LG10-2.4A高速離心機(jī)(北京京立);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

        1.2 試藥

        紅豆越橘采收自黑龍江省伊春市,經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為杜鵑花科越橘屬植物(Vaccinium vitis-idaeaL.)的果實(shí);DPPH(上海阿拉?。?;SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所);維生素C(VC),甲醇,冰醋酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán));白砂糖為市售;蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

        2 方法

        2.1 紅豆越橘酵素的制備

        挑選成熟、無(wú)霉變的紅豆越橘果實(shí),除去樹(shù)葉、雜質(zhì),用無(wú)菌水洗去泥沙,勻漿,分別稱取50 g紅豆越橘置于無(wú)菌密封罐中,按比例加入無(wú)菌水及白砂糖,恒溫下發(fā)酵,每隔2 d放氣一次,發(fā)酵終止后過(guò)濾,于紫外燈下照射2 h終止發(fā)酵。

        2.2 單因素試驗(yàn)

        2.2.1 發(fā)酵溫度的確定 稱取紅豆越橘50 g,白砂糖10 g,料液比1:2,按紅豆越橘酵素的制備方法,分別在15,20,25,30,35 ℃恒溫發(fā)酵20 d,發(fā)酵終止后,測(cè)定其SOD酶活力,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

        2.2.2 料液比的確定 稱取紅豆越橘50 g,白砂糖10 g,25 ℃恒溫,分別按料液比2:1,1:1,1:2,1:3,1:4加入無(wú)菌水,按紅豆越橘酵素的制備方法,發(fā)酵20 d,發(fā)酵終止后,測(cè)定其SOD酶活力,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

        2.2.3 白砂糖用量的確定 稱取紅豆越橘50 g, 25 ℃恒溫,料液比1:2,按紅豆越橘酵素的制備方法,分別加入6,8,10,12,14 g白砂糖,發(fā)酵20 d,發(fā)酵終止后,測(cè)定其SOD酶活力,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

        2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定 稱取紅豆越橘50 g,白砂糖10 g,料液比1:2,25 ℃恒溫,按紅豆越橘酵素的制備方法,分別發(fā)酵10,15,20,25,30 d,發(fā)酵終止后,測(cè)定其SOD酶活力,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

        2.3 正交試驗(yàn)

        通過(guò)單因素試驗(yàn),確定以發(fā)酵溫度、料液比、白砂糖用量及發(fā)酵時(shí)間為考察因素(見(jiàn)表1),選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定SOD酶活力。挑選20名對(duì)色澤、氣味、滋味及組織形態(tài)都比較敏感的人員,按表2感官評(píng)價(jià)指標(biāo)要求進(jìn)行評(píng)分(滿分100分),求取平均值。根據(jù)綜合評(píng)分篩選最佳發(fā)酵條件。綜合評(píng)分=感官評(píng)分×0.5+SOD酶活力×0.5。

        表1 因素水平表

        表2 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

        2.4 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的測(cè)定[9-11]

        2.4.1 DPPH工作液的配制 精密稱取39.4 mg DPPH于100 ml量瓶,甲醇溶解,定容,4 ℃下避光保存,即得DPPH儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前移取DPPH儲(chǔ)備液15 ml,甲醇定容至100 ml,制成0.15 mmol/L DPPH工作液。

        2.4.2 VC對(duì)照品溶液的配制 精密稱取VC10.0 mg,蒸餾水溶解,定容至10 ml量瓶,即得VC對(duì)照品溶液。測(cè)定前,分別移取20,40,60,80 μl VC對(duì)照品溶液,稀釋至10 ml,測(cè)定其吸光度。

        2.4.3 紅豆越橘酵素樣品溶液的制備 精密吸取紅豆越橘酵素原液200 μl,用蒸餾水定容至10 ml,即得紅豆越橘酵素稀釋液。再分別吸取400,500,600,700,800 μl稀釋液,定容至10 ml,即得紅豆越橘酵素樣品溶液。

        2.4.4 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的測(cè)定在試管中加入0.15 mmol/L的DPPH工作液3.2 ml,再加入紅豆越橘酵素樣品溶液0.8 ml,混勻后,25 ℃避光反應(yīng)30 min,517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以VC作為陽(yáng)性對(duì)照[12-13]。按下式計(jì)算DPPH自由基的清除率(%)。

        式中A0為DPPH溶液和蒸餾水混合液的吸光度;A1為DPPH溶液和紅豆越橘酵素樣品溶液混合液的吸光度。

        2.5 紅豆越橘酵素SOD酶活力的測(cè)定

        將紅豆越橘酵素液4000 r/min離心10 min,吸取上清,按SOD酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD酶活力。

        2.6 數(shù)據(jù)分析

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

        3 結(jié)果

        3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),在15~30 ℃之間,紅豆越橘酵素的SOD酶活力隨溫度的升高顯著增長(zhǎng),溫度達(dá)35 ℃時(shí),呈驟然下降趨勢(shì),分析可能是溫度過(guò)高影響酶的活性。

        圖1 發(fā)酵溫度對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        3.1.2 料液比對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),隨料液比增加,SOD酶活力值呈上升趨勢(shì),當(dāng)料液比達(dá)1:2時(shí),SOD酶活力達(dá)最高值,之后呈緩慢下降趨勢(shì),分析可能是達(dá)最佳料液比后,隨料液比增加,酵素濃度下降。

        圖2 料液比對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        3.1.3 白砂糖用量對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),隨白砂糖用量的增加,紅豆越橘酵素的SOD酶活力呈顯著上升趨勢(shì),當(dāng)白砂糖用量達(dá)10 g時(shí),SOD酶活力值最高,隨后呈緩慢下降趨勢(shì)。

        圖3 白砂糖用量對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        3.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆越橘酵素SOD酶活力的影響

        結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),隨發(fā)酵時(shí)間的增加,紅豆越橘酵素SOD酶活力值顯著增加,發(fā)酵時(shí)間在25~30 d時(shí),SOD酶活力基本趨于平穩(wěn)。

        圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆越橘酵素的影響

        3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

        正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。由表3、表4可見(jiàn),4個(gè)因素對(duì)紅豆越橘酵素影響次序?yàn)镃(白砂糖用量)>A(發(fā)酵溫度)>D(發(fā)酵時(shí)間)>B(料液比),其中白砂糖用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P<0.05),發(fā)酵溫度、料液比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。根據(jù)直觀分析結(jié)果,確定最佳工藝條件為A2B1C1D2,即紅豆越橘50 g,發(fā)酵溫度30 ℃,料液比1:1(g/ml),白砂糖用量8 g,發(fā)酵時(shí)間20 d。

        表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

        表4 方差分析

        3.3 紅豆越橘酵素清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果

        紅豆越橘酵素與VC對(duì)照品溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo),以紅豆越橘酵素稀釋液及VC對(duì)照品溶液體積為橫坐標(biāo)做圖,得紅豆越橘酵素清除DPPH自由基線性方程:Y=0.0828X-0.18,R2=0.9971;VC清除DPPH自由基線性方程:Y=1.1695X+14.5,酵素清除DPPH自由基線性方程:Y=0.0828X-0.18,R2=0.9976。由方程可知,當(dāng)清除率為50 %時(shí),606 μl紅豆越橘酵素稀釋液與30 μl 1 mg/ml VC溶液的抗氧化能力相當(dāng)。

        圖5 VC對(duì)DPPH自由基的清除能力

        圖6 紅豆越橘酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力

        3.4 紅豆越橘酵素SOD酶活力測(cè)定結(jié)果

        紅豆越橘發(fā)酵前SOD酶活力為1488 U/ml,按最佳工藝條件發(fā)酵后,SOD酶活力為3624 U/ml。

        4 結(jié)論

        本研究以紅豆越橘果實(shí)為原料,在不添加菌種的條件下,對(duì)紅豆越橘進(jìn)行了自然發(fā)酵,通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)分析,以感官評(píng)價(jià)及SOD酶活力綜合評(píng)分為考察指標(biāo),得出最佳發(fā)酵條件:紅豆越橘50 g,發(fā)酵溫度30 ℃,料液比1:1,白砂糖用量8 g,發(fā)酵時(shí)間20 d。通過(guò)DPPH自由基清除能力及SOD酶活力測(cè)定,對(duì)紅豆越橘酵素的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究,發(fā)酵后紅豆越橘酵素SOD酶活力顯著提高,說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程能更好地促進(jìn)SOD的形成。結(jié)果表明,紅豆越橘酵素具有較好的抗氧化性能。

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