吳志偉，紀(jì)煥文，閆筱新

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 內(nèi)科，河南 鄭州 450007)

隨著人口老齡化的不斷加速以及工業(yè)化的快速發(fā)展，空氣質(zhì)量明顯變差，臨床肺臟疾病患者數(shù)量明顯增多[1]。肺纖維化是多種肺臟疾病發(fā)展到終末期的病變，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞大量增生，肺長皮細(xì)胞組織炎癥損傷、結(jié)構(gòu)破壞等[2]。肺纖維化對人體呼吸功能以及肺功能損害嚴(yán)重，死亡率甚至超過許多腫瘤類疾病。目前臨床關(guān)于肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究較多，但結(jié)論差異較大。PTEN基因具備磷酸酯酶的活性，已有大量臨床研究表明，PTEN能夠通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性起到抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲作用[3]。而近年來，有研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因可能參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)存在于幾乎所用動物細(xì)胞中，在細(xì)胞炎癥以及免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)可引發(fā)機(jī)體發(fā)生多種炎癥、免疫或腫瘤類疾病[5]。有研究表明，PTEN基因可能通過P13K/Akt信號調(diào)控NF-κB基因的表達(dá)[6]，但尚未明確這一過程是否與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)。本研究通過制備大鼠模型，旨在探討下調(diào)PTEN基因是否能夠通過NF-κB介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞衰老參與肺纖維化發(fā)病。

1 材料和方法

1.1 動物的選取清潔級健康雄性SD大鼠210只，8～10周，體質(zhì)量(175.48±5.36)g，購買于南京卡爾文。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適當(dāng)飲水，適當(dāng)光照，飼養(yǎng)7 d后投入實(shí)驗(yàn)。

1.2 動物分組與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組及給藥 將60只SD大鼠隨機(jī)分為A、B兩組，每組30只。將PTEN inhibitor溶于人工腦脊液(上海信帆生物)，濃度20 μmol·L-1，給予B組大鼠PTEN inhibitor側(cè)腦室注射，共注射6 μL，速度為1 μL·min-1，A組大鼠只接受人工腦脊液注射。

1.2.2PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平檢測 (1)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA以及內(nèi)參U6的引物序列表U6引物(上海生工生物工程公司)。(2)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA在大鼠肺上皮細(xì)胞的表達(dá)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格根據(jù)說明書進(jìn)行操作，用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶和寡核苷酸按照操作說明書合成cRNA。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：緩沖液4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，總RNA 2 μL，去RNA酶水12 μL；反應(yīng)條件：42 ℃水浴1 h，95 ℃水浴5 min；使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以RNU6B作為內(nèi)參對照，根據(jù)操作說明書使用MiR-29c、Birc2及Bak1的特異引物在熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、mir 0.5 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系，實(shí)時PCR的條件為：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 15 s，然后40個循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用相對定量法分析。見表1。

表1 PTEN mRNA、NF-κB mRNA、P16 mRNA、P21 mRNA以及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.3PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平檢測 采用Western Blot法對大鼠處死后的肺上皮細(xì)胞的PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平進(jìn)行檢測，檢測步驟如下：取大鼠缺血側(cè)腦組織標(biāo)本，勻漿器充分研磨后加入裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小配置適合濃度的凝膠、分離膠和濃縮膠。電泳加壓轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h。加入特異性PTEN、NF-κB、P16、P21抗體，稀釋比例為1∶1 000，以β-actin(1∶5 000)作為對照。去除一抗，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，漂洗，化學(xué)發(fā)光法X片顯影，采用Image J軟件得到條帶灰度值，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4肺上皮細(xì)胞凋亡情況 采集死后大鼠肺上皮細(xì)胞，置于500 μL的結(jié)合緩沖液，用5 μL的FITC-Annexin V試劑(BestBio-貝博生物)和碘化丙啶(美侖生物)雙標(biāo)記凋亡細(xì)胞30 min。在1 h內(nèi)采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD Bioscience)對細(xì)胞進(jìn)行分析。以Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+象限的凋亡細(xì)胞百分率表示凋亡率。每個樣本重復(fù)3次。

1.2.5大鼠肺組織HE染色 將脫蠟至水的大鼠肺組織切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘；將切片放入酸水及氨水中分色，5～8 s；流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻；在體積分?jǐn)?shù)為70%和90%酒精中脫水各10 min；酒精伊紅染色液染色2～3 min；染色后的切片經(jīng)純潘精脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明；將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。所有HE染色液均購買于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)(1)大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21mRNA水平；(2)大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21蛋白水平；(3)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA之間的相關(guān)性；(4)大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡率；(5)大鼠肺組織染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平與A組大鼠相比，B組大鼠的PTENmRNA水平偏低，而NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平均偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。降低NF-κBmRNA可能通過激活NF-κBmRNA促進(jìn)衰老基因P16mRNA、P21mRNA水平升高。見表2。

表2 兩組大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21 mRNA水平比較

2.2 PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平與A組大鼠相比，B組大鼠的PTEN蛋白水平偏低，而NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平均偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21蛋白水平比較

2.3 相關(guān)性分析logistic分析結(jié)果顯示，PTENmRNA與NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.624、-0.637、-0.598，P<0.05)，NF-κBmRNA與P16mRNA、P21mRNA均呈正相關(guān)(r=0.631、0.628，P<0.05)。

2.4 肺上皮細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，A組大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡率為(4.62±0.49)%，B組大鼠的肺上皮細(xì)胞凋亡率為(26.47±1.85)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，B組大鼠肺纖維斷裂、重排及變性壞死情況嚴(yán)重，細(xì)胞間隙明顯變寬，肺上皮細(xì)胞排列雜亂，肺上皮細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；A組大鼠肺上皮細(xì)胞無明顯損壞，排列較為整齊，形基本正常，炎癥細(xì)胞浸潤較少，肺纖維無明顯斷裂、重排及變性壞死。

3 討論

肺纖維化是多種間質(zhì)性肺疾病發(fā)展到終末期肺臟表現(xiàn)之一。已有臨床研究表明，肺上皮細(xì)胞衰老參與了肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程[7]。如何減少肺上皮細(xì)胞衰老，抑制肺纖維化發(fā)展已成為臨床研究熱點(diǎn)問題。PTEN是機(jī)體內(nèi)較為常見的抑癌基因，而NF-κB則為一種機(jī)體內(nèi)較為主要的炎癥介質(zhì)，兩者均已被證實(shí)與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。本文旨在探討PTEN基因缺失是否能夠激活NF-κB介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞衰老參與肺纖維化發(fā)病。

本研究對兩組大鼠造模后肺上皮細(xì)胞組織的PTEN、NF-κB、P16、P21mRNA及其蛋白水平進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)PTEN inhibitor人工腦脊液注射，其PTEN蛋白及mRNA水平上升，而NF-κB、P16、P21蛋白及mRNA均下降，并且PTENmRNA與NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA均呈負(fù)相關(guān)，而NF-κBmRNA與P16mRNA、P21mRNA均呈正相關(guān)。B組大鼠PTEN蛋白及mRNA水平的上升說明了本次造模的成功性。P16、P21均為機(jī)體內(nèi)較為主要的衰老基因，其表達(dá)水平能夠在一定程度上反映細(xì)胞衰老和凋亡速度[10]。本研究結(jié)果中B組大鼠肺上皮細(xì)胞組織P16、P21表達(dá)明顯升高，說明其肺上皮細(xì)胞衰老速度明顯加快。NF-κB參與了機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡、衰老過程，Mou等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，NF-κB還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老速度，NF-κB在衰老細(xì)胞組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。You等[12]研究顯示，NF-κB在衰老疾病患者體內(nèi)表達(dá)異常偏高，如老年癡呆、動脈硬化、肝硬化等。PTEN是定位于染色體10q23.3，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，已有臨床研究表明PTEN與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)。Bo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN能夠通過P13K/Akt信號負(fù)性調(diào)控NF-κB的表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致。因此，本研究中，降低PTEN基因可能通過激活NF-κB調(diào)高大鼠肺上皮組織P16、P21的表達(dá)水平，并促進(jìn)肺上皮細(xì)胞衰老。

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，B組大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡率高于A組，而HE染色結(jié)果表明，B組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)較為明顯的肺纖維化，A組大鼠肺組織未遭受明顯破壞，這表明調(diào)低PTEN基因可能通過負(fù)向調(diào)控NF-κB促進(jìn)肺大鼠上皮細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致大鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。Xie等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為機(jī)體內(nèi)較為主要的炎癥信號通路，具備明顯的促肺上皮細(xì)胞凋亡作用，抑制其表達(dá)有利于減少肺上皮細(xì)胞凋亡，并改善機(jī)體肺纖維化病情。Li等[14]研究結(jié)果顯示，烏司他丁藥物可通過降低機(jī)體內(nèi)NF-κB、TNF-β1以及TNF-α表達(dá)水平改善肺纖維化患者病情預(yù)后，NF-κB是參與肺纖維化病情發(fā)生發(fā)展的重要炎癥細(xì)胞因子之一。Qiu等[15]研究顯示，PTEN作為一種抑癌基因，其水平降低表明可直接通過加速肺上皮細(xì)胞衰老，促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展，又可以通過P13K/Akt信號負(fù)性調(diào)控NF-κB基因的表達(dá)水平而促進(jìn)肺纖維化病情發(fā)生演變，這與本研究結(jié)果一致。因此，本研究結(jié)果中，調(diào)低大鼠PTEN基因表達(dá)，可能通過激活NF-κB促進(jìn)肺大鼠上皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)大鼠肺纖維化。

綜上所述，PTEN基因缺失可能通過激活NF-κB介導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞衰老，并導(dǎo)致肺纖維化病情發(fā)生。本研究尚存在一些不足之處，例如本研究僅進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)，說服力有限，今后的研究可增設(shè)人體肺組織細(xì)胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)，以便于進(jìn)一步探討PTEN基因缺失是否能夠通過激活NF-κB介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞衰老，并導(dǎo)致人體肺纖維化病情的發(fā)生發(fā)展。