余倩倩，童慶紅

(潢川縣人民醫(yī)院 病理科，河南 信陽 465150)

手術(shù)是治療結(jié)腸癌的重要方式，早期患者可在手術(shù)治療后獲得長期生存，而對于中晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，也可通過術(shù)后化療延長生存期，挽救患者生命，但不同臨床分期患者治療方法不盡相同，且預(yù)后存在一定差異[1]。因此，尋求可有效評估結(jié)腸癌患者臨床分期的指標(biāo)有重要意義。目前對于結(jié)腸癌臨床分期主要采取影像學(xué)診斷，但常規(guī)影像學(xué)診斷有一定滯后性，無法及時反映病灶變化，評估臨床分期的價值一般。生物學(xué)標(biāo)志物是評估腫瘤臨床分期的重要方式，多腫瘤抑制基因P16是一種蛋白標(biāo)志物，可抑制多種細(xì)胞周期蛋白/細(xì)胞周期依賴性蛋白酶復(fù)合物的激酶活性，從而抑制細(xì)胞生長，與腫瘤發(fā)展有關(guān)[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)屬于促血管生成因子，與腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。由此推測組織中P16、VEGF表達(dá)可能與結(jié)腸癌患者臨床分期相關(guān)。鑒于此，本研究著重分析組織中P16、VEGF表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年5月至2021年5月潢川縣人民醫(yī)院收治的80例結(jié)腸癌患者臨床資料。80例患者中男47例，女33例；年齡34～60歲，平均(46.60±2.37)歲；腫瘤直徑2～7 cm，平均(4.30±0.85)cm；病理類型腺癌64例，腺鱗癌16例。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)腸癌符合《中國結(jié)直腸癌預(yù)防共識意見》[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理診斷檢查確診；②術(shù)前未接受放化療；③在潢川縣人民醫(yī)院完成病理學(xué)檢查；④臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②同期需行其他手術(shù)治療；③合并免疫功能障礙；④合并血液系統(tǒng)疾病。

1.2 結(jié)腸癌患者臨床分期評估及分組方法采用腫瘤(tumor node metastasis，TNM)[5]分期標(biāo)準(zhǔn)，0～Ⅰ期為原發(fā)腫瘤僅局限于黏膜內(nèi)或黏膜下層，無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅱ期為原發(fā)腫瘤侵犯腸壁肌層，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅲ期為無論原發(fā)腫瘤侵犯深度，存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；Ⅳ期為腫瘤轉(zhuǎn)移至其他器官，腹腔種植轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。將0～Ⅰ期患者資料納入早期組，將Ⅱ期、Ⅲ期患者資料納入中期組；將Ⅳ期患者資料納入晚期組。

1.3 組織中P16、VEGF檢查方法及陽性判定標(biāo)準(zhǔn)80例患者均在術(shù)中取腫瘤組織，常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，厚4 μm連續(xù)切片，石蠟切片脫水化后，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)浸泡5 min，隨后組織抗原微波修復(fù)；加內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑，室溫下孵育10 min，然后使用PBS沖洗3次，每次3 min；加封閉用正常山羊血清工作液，室溫下孵育20 min，滴加P16、VEGF 1抗，4 ℃冷藏過夜；PBS沖洗3次，每次3 min，加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗，每次3 min，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；加過氧化物酶顯色底物顯色劑，5～10 min，顯色完畢，使用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化10 s，碳酸鋰返藍(lán)10 s，脫水、透明、封片。P16、VEGF陽性標(biāo)準(zhǔn)：采用染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分率的半定量積分法判定，P16陽性表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，VEGF陽性表達(dá)于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，于高倍視野(×400)下隨機(jī)選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率，≤10%(0分)、>10%～25%(1分)、>25%～50%(2分)、>50%～100%(3分)；著色深淺評分，無顯色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；兩類分?jǐn)?shù)乘積<3分為陰性，否則為陽性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者臨床分期情況80例結(jié)腸癌患者中，0～Ⅰ期19例(23.75%)，Ⅱ期24例(30.00%)，Ⅲ期26例(32.50%)，Ⅳ期11例(13.75%)。

2.2 不同臨床分期結(jié)腸癌患者基線資料中/晚期組組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)患者占比高于早期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中期組、晚期組組織中P16、VEGF表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同臨床分期患者其他基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床分期結(jié)腸癌患者基線資料比較

2.3 組織中P16、VEGF表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期的相關(guān)性分析將結(jié)腸癌患者臨床分期作為因變量(“1”=中/晚期，“0”=早期)，并將表1中經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量(組織中P16表達(dá)、組織中VEGF表達(dá))納入作為自變量(賦值情況見表2)，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示，組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床高分期有關(guān)(OR>1，P<0.05)。見表3。

表2 變量賦值說明

表3 組織中P16、VEGF表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期的相關(guān)性分析

3 討論

以手術(shù)為主的綜合方案是目前治療結(jié)腸癌的重要手段，早期結(jié)腸癌患者經(jīng)上述方案治療后生存率得到顯著提高，預(yù)后較好；但中晚期患者腫瘤侵犯淋巴結(jié)及周圍組織，在一定程度上增加治療難度，術(shù)后易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致不良預(yù)后[6]。本研究結(jié)果顯示，80例結(jié)腸癌患者中，中晚期患者61例，占比76.25%?？梢?，結(jié)腸癌患者確診時往往為中晚期，因此，明確患者臨床分期對患者治療方案的擬定十分必要。

P16基因是一種細(xì)胞周期中的基本基因，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，可負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，對抑制腫瘤生長有重要意義[7]。VEGF可通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合，參與調(diào)解腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤生長提供營養(yǎng)[8]。由此推測組織中P16、VEGF可能與結(jié)腸癌臨床分期相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，中、晚期組組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)患者占比高于早期組，并經(jīng)logistic回歸分析，結(jié)果顯示，組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期密切相關(guān)，表明組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床高分期相關(guān)。分析其原因在于，P16基因是重要的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物P16蛋白可通過與周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)相結(jié)合，調(diào)控CDK4/周期蛋白的D復(fù)合產(chǎn)物的催化活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，控制其惡性程度[9]。但當(dāng)P16基因缺失或P16蛋白低表達(dá)，使細(xì)胞增殖程序失控，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，同時缺失P16蛋白還可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致臨床分期升高。因此，組織中P16陰性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床分期密切相關(guān)。腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程涉及多種因素，其中血管生成是重要因素。VEGF可通過與其特異性受體相結(jié)合，使受體自身磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂，誘導(dǎo)新生血管生成并增加血管通透性，為腫瘤生長及侵襲提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌患者臨床分期升高[10]。

綜上所述，組織中P16陰性表達(dá)、VEGF陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床高分期存在一定聯(lián)系，未來臨床可通過檢測患者組織中P16、VEGF表達(dá)情況，評估患者臨床分期。