蒲舉 季一飛 龍繼發(fā) 周華勇 楊旭 張揚(yáng)威 柳華

(1.南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000；2.西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院·成都市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610031)

血腦屏障通過(guò)調(diào)節(jié)必要的營(yíng)養(yǎng)素、離子和激素的運(yùn)輸來(lái)幫助維持腦穩(wěn)態(tài)，同時(shí)由于復(fù)合膜而阻止神經(jīng)毒素或病原體進(jìn)入大腦；其完整性的喪失與阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和多發(fā)性硬化癥以及腦腫瘤相關(guān)[1-2]。腦微血管的內(nèi)皮細(xì)胞是組成血腦屏障的重要細(xì)胞類(lèi)型，有助于血腦屏障的完整性，并有助于控制運(yùn)輸過(guò)程[1]。微小RNA(microRNA，miRNA/miRs)是約22個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，通過(guò)與特定靶標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′ UTR)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。最近的研究表明，miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中異常表達(dá)，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[4]。miR-20a-5p被報(bào)道在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中顯著下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可以減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[5]。但miR-20a-5p在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的潛在功能尚不明確。本研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出miR-20a-5p和骨形成蛋白2型受體(Bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)存在結(jié)合位點(diǎn)，BMPR2可能是miR-20a-5p的靶基因。研究表明，BMPR2的下調(diào)促進(jìn)肺動(dòng)脈細(xì)胞的增殖過(guò)程[6]。但miR-20a-5p是否通過(guò)靶向BMPR2參與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡，目前仍未可知。基于此，本研究考察miR-20a-5p對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并通過(guò)miR-20a-5p和BMPR2之間的靶向關(guān)系研究，旨在探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)來(lái)自美國(guó)典藏培養(yǎng)物中心，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EBM-2購(gòu)自瑞士Lonza公司，噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTM購(gòu)自大連Takara Bio公司，抗BMPR2、抗細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、抗活化的的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、抗磷酸化-磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)Ⅰ抗、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG Ⅱ抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]的報(bào)道，將hCMEC/D3在含5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)基。

1.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 miR-20a-5p mimics、陰性對(duì)照miR-NC、miR-20a-5p inhibitor(anti-miR-20a-5p)、陰性對(duì)照anti-miR-NC、BMPR2小干擾RNA(si-BMPR2)、小干擾RNA(si-NC)、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-BMPR2)、空載pcDNA-NC從上海GenePharma公司獲得。將hCMEC/D3分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)，miR-20a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-BMPR2組(轉(zhuǎn)染si-BMPR2)、pcDNA-NC組(轉(zhuǎn)染pcDNA-NC)、pcDNA-BMPR2組(轉(zhuǎn)染pcDNA-BMPR2)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-20a-5p組(轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor)、miR-20a-5p+pcDNA-NC組(共轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics和pcDNA-NC)、miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組(共轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics和pcDNA-BMPR2)。hCMEC/D3接種于6孔板，其融合度為70%時(shí)，通過(guò)Lipofectamine 2000按照上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37℃和5% CO2條件下溫育6 h，將培養(yǎng)基更換為常規(guī)培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染48 h后，從hCMEC/D3中提取總RNA和蛋白，分別使用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)測(cè)定miR-20a-5p和BMPR2表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-20a-5p表達(dá) 為了檢測(cè)miR-20a-5p表達(dá)，使用TRIzol試劑從hCMEC/D3提取總RNA。然后，通過(guò)測(cè)定260和280 nm處的吸光度來(lái)確定RNA濃度，A260/A280比為1.8～2.0表示可接受的純度。接下來(lái)使用PrimeScriptTMRT Master Mix，將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。于ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)熱循環(huán)儀上使用SYBR?Premix Ex TaqTM進(jìn)行PCR。用于擴(kuò)增的引物為miR-20a-5p 5′-GCCCGCTAAAGTGCTTATAGTG-3′(正向引物)和5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′(反向引物)。U6：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3′(正向引物)和5′-CCAGTGCAGGGAGGT-3′(反向引物)。U6用作內(nèi)部對(duì)照。使用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.5 Western Blot檢測(cè)BMPR2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT蛋白水平 轉(zhuǎn)染后的hCMEC/D3用冰RIPA緩沖液提取，使用雙辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定法評(píng)估蛋白質(zhì)濃度。然后，將30 μg /泳道蛋白轉(zhuǎn)移到10% PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶在37℃處理2 h封閉膜。PVDF膜沖洗后，將膜與Ⅰ抗在4℃孵育過(guò)夜?？贵w如下：BMPR2(1∶1000)、CyclinD1(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶3000)、p-PI3K(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)和β-actin(加樣對(duì)照，1∶3000)。之后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG Ⅱ抗(1∶1500)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)ECL試劑檢測(cè)印跡ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析定量蛋白表達(dá)。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96孔板中接種hCMEC/D3，按照1.3中分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后在細(xì)胞中加入5 mg/mL的MTT溶液，每孔20 μL，繼續(xù)孵育4 h。加入200 μL二甲基亞砜，震蕩培養(yǎng)10 min。在450 nm波長(zhǎng)處，記錄Bio Tek酶標(biāo)儀中細(xì)胞的吸光度值OD450nm，以O(shè)D450nm代表細(xì)胞活性。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)步驟，收集轉(zhuǎn)染48 h后hCMEC/D3，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶黑暗孵育細(xì)胞15 min。于FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 使用starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)miR-20a-5p的潛在靶標(biāo)。對(duì)于螢光素酶報(bào)告基因分析，使用pGL3螢光素酶報(bào)告載體構(gòu)建BMPR2-3′ UTR野生型(WT)及突變型(MUT)片段，該片段包含miR-20a-5p的結(jié)合序列。使用Lipofectamine 2000將BMPR2-3′ UTR-WT或BMPR2-3′ UTR-MUT和miR-20a-5p mimics或miR-NC轉(zhuǎn)染到hCMEC/D3中。培養(yǎng)48 h后，收獲細(xì)胞，通過(guò)Promega雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 在hCMEC/D3中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics后，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p組miR-20a-5p表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于miR-NC組(P<0.05)，提示成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-20a-5p的細(xì)胞。Western Blot、MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-20a-5p組hCMEC/D3的CyclinD1蛋白量和細(xì)胞活性明顯高于miR-NC組，Cleaved-caspase-3蛋白量和細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

表1 過(guò)表達(dá)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

2.2 BMPR2對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 在hCMEC/D3中轉(zhuǎn)染BMPR2小干擾RNA(si-BMPR2)或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-BMPR2)，Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，發(fā)現(xiàn)si-BMPR2組BMPR2蛋白水平明顯低于si-NC組，而pcDNA-BMPR2組BMPR2蛋白水平明顯高于pcDNA-NC組，提示轉(zhuǎn)染有效。Western Blot、MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，與si-NC組比較，si-BMPR2組hCMEC/D3的CyclinD1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活性顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-BMPR2組hCMEC/D3中CyclinD1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活性顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

表2 BMPR2對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測(cè)BMPR2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.3 miR-20a-5p靶向BMPR2，調(diào)控BMPR2蛋白的表達(dá) 采用starbase預(yù)測(cè)了miR-20a-5p的假定靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)BMPR2-3′ UTR包含miR-20a-5p的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。為了證實(shí)miR-20a-5p和BMPR2之間的關(guān)聯(lián)，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)用BMPR2-3′ UTR-WT轉(zhuǎn)染hCMEC/D3時(shí)，與miR-20a-5p mimics的共轉(zhuǎn)染可抑制熒光素酶活性(P<0.05)，而B(niǎo)MPR2-3′ UTR-MUT與miR-20a-5p mimics共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)表明，與miR-NC組比較，在轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics的細(xì)胞中BMPR2蛋白水平降低；與anti-miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p的細(xì)胞中BMPR2蛋白水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3，表3、4。

表3 miR-NC或miR-20a-5p與BMPR2-3′ UTR-野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hCMEC/D3后雙熒光素酶活性檢測(cè)

圖3 miR-20a-5p靶向BMPR2，調(diào)控BMPR2蛋白的表達(dá)

2.4 高表達(dá)BMPR2可以逆轉(zhuǎn)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 Western Blot、MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-20a-5p+pcDNA-NC組比較，miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組hCMEC/D3的BMPR2蛋白水平明顯增加，CyclinD1蛋白水平顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表5、圖4。

表4 Western Blot檢測(cè)BMPR2蛋白表達(dá)

表5 高表達(dá)BMPR2可以逆轉(zhuǎn)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

圖4 高表達(dá)BMPR2可以逆轉(zhuǎn)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

2.5 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) Western Blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果表明，與miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics明顯提高h(yuǎn)CMEC/D3中p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)；與miR-20a-5p+pcDNA-NC組比較，miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組顯著降低hCMEC/D3中p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)表6、圖5。

圖5 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表6 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

已有研究證實(shí)miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成中的重要性[8-9]。miR-20a-5p作為miR-17-92基因簇的成員，在腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展具有關(guān)鍵作用[10-11]。例如，胰腺癌中miR-20a-5p表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡的作用[12]。在ox-LDL刺激的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)中檢測(cè)到miR-20a的表達(dá)受抑制，過(guò)表達(dá)miR-20a可能通過(guò)靶向TLR4和NLRP3信號(hào)傳導(dǎo)，從而保護(hù)HAEC免受ox-LDL誘導(dǎo)的炎性損傷，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[13]。本實(shí)驗(yàn)為了研究miR-20a-5p在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能和意義，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics以過(guò)表達(dá)miR-20a-5p。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-20a-5p使hCMEC/D3的細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低。提示miR-20a-5p在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促增殖和抗凋亡作用。

BMPR2是細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程的重要調(diào)控因素，在某些癌癥的發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[14-15]。既往研究表明，BMPR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性和血管壁的重構(gòu)參與肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展[16]。BMPR2的異常造成肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低表達(dá)BMPR2明顯提高h(yuǎn)CMEC/D3的細(xì)胞活性、CyclinD1蛋白表達(dá)水平，顯著減少細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平，高表達(dá)BMPR2時(shí)具有相反的效果。miRNA通過(guò)與3′ UTR的互補(bǔ)位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄本的翻譯區(qū)域結(jié)合，對(duì)目標(biāo)mRNA進(jìn)行翻譯抑制或降解[18]。為了確定進(jìn)一步的機(jī)制，本研究使用starbase篩選了miR-20a-5p可能的靶基因，BMPR2被確定為潛在靶點(diǎn)。正如生物信息學(xué)所預(yù)測(cè)的那樣，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)了miR-20a-5p對(duì)BMPR2的靶向調(diào)控作用。此外，為了鑒定miR-20a-5p是否調(diào)節(jié)hCMEC/D3中BMPR2的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimics或miR-20a-5p inhibitor后的BMPR2水平。結(jié)果表明，上調(diào)miR-20a-5p后，hCMEC/D3中BMPR2蛋白水平降低，而在下調(diào)miR-20a-5p后，BMPR2蛋白水平升高。另外，高表達(dá)BMPR2可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-20a-5p對(duì)hCMEC/D3增殖的促進(jìn)作用及對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。這些結(jié)果表明，BMPR2是miR-20a-5p的功能性靶標(biāo)。根據(jù)報(bào)道，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有利于miR-126減輕缺血再灌注引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[19]。miR-20a通過(guò)激活PTEN/PI3K/AKT途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞輻射抗性[20]。本實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-20a-5p明顯促進(jìn)hCMEC/D3中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-20a-5p激活PI3K/AKT信號(hào)通路活性的作用被高表達(dá)BMPR2所逆轉(zhuǎn)。提示miR-20a-5p通過(guò)靶向BMPR2并激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而參與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程。

4 結(jié)論

過(guò)表達(dá)miR-20a-5p可以促進(jìn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向細(xì)胞中的BMPR2及提高PI3K/AKT信號(hào)通路活性有關(guān)，為血腦屏障相關(guān)疾病的研究提供了新的線索。