何花麗 朱明霞 趙小娟 單兆亞 任天彤

(1.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.西安市第四醫(yī)院，陜西 西安 710004)

子宮內(nèi)膜癌是子宮癌的一種，屬于子宮內(nèi)膜上皮惡性腫瘤，最常見的子宮癌是子宮內(nèi)膜腺源性腺癌，占75%～80%[1-2]。約67%的宮內(nèi)膜癌患者處于早期階段，約21%局部擴散到盆腔淋巴結(jié)和周圍器官，約8%發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[3]。迄今為止，子宮內(nèi)膜癌的主要治療方法是手術，然后是輔助放療和化學療法[4-5]。 但這些療法并未有效降低子宮內(nèi)膜癌死亡的風險，術后2～3年，子宮內(nèi)膜癌的復發(fā)率高于60%～80%[6]。目前，越來越多的研究表明麻醉藥和麻醉技術對術后復發(fā)有益，并且可以提高各種癌癥的存活率[7-8]。羅哌卡因是一種酰胺連接的局部麻醉藥，可通過阻斷電壓門控鈉通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)流入阻止軸突中傳播的動作電位的產(chǎn)生[9]。VGSC在癌細胞中功能上過表達，并參與局部麻醉藥的抗癌活性[10]。據(jù)報道，羅哌卡因在多種類型的癌癥中會抑制其生長、遷移和存活[11]。羅哌卡因在癌細胞中作用的分子機制似乎是癌癥特異性的，包括上調(diào)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和激活的促絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑，抑制Src活性，阻斷磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 和粘著斑激酶信號途徑[11-13]。研究表明，羅哌卡因抑制長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA) THRIL 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、細胞周期和遷移[14]。但是羅哌卡因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細胞的微管形成和氧化損傷尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及處理 HEC-1B和Ishikawa 細胞購于中國科學院細胞庫，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱。

1.2 CCK-8法檢測細胞活性 在96孔板中，將HEC-1B和Ishikawa細胞分別用不同濃度羅哌卡因(0.1、0.5和1 mM)處理24、48、72 h時，然后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液。最后用酶免疫分析儀在450 nm處測量吸光度。各濃度處理組細胞的吸光度與0.15 mmol/L組細胞的吸光度的比值表示細胞活性。

1.3 Western blot檢測蛋白水平 HEC-1B和Ishikawa細胞處理后，裂解緩沖液裂解細胞，然后在4℃并以14000 rpm離心15 min，濃縮蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度由BCA蛋白定量檢測盒(上海碧云天生物有限公司)進行測量。取20 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在37℃下用1 h封閉5%的牛血清白蛋白，然后與抗E-cadherin、Vimentin和VEGF在4℃過夜。用TTBS洗滌后緩沖液[含0.5 mL Tween-20(sigma, USA)的Tris緩沖鹽水]，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)37℃反應1 h；洗膜后ECL曝光成像并應用quantity one(Bio-Rad, San Francisco, California，USA)軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖率 將HEC-1B和Ishikawa 細胞用1 mM羅哌卡因處理，用冷的甲醇-冰醋酸固定HEC-1B和Ishikawa細胞，并用結(jié)晶紫染色。

1.5 流式細胞術檢測細胞的凋亡率 流式細胞儀檢測HEC-1B和Ishikawa細胞凋亡，采用Annexin v-熒光素(AV)和碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)流式細胞術檢測不同處理HEC-1B和Ishikawa細胞的凋亡率。刺激后，用PBS洗滌細胞，10 L Annexin V-FITC和5 L PI在室溫黑暗中孵育15 min。流式細胞術使用FACScan流式細胞儀(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)進行流式分析，數(shù)據(jù)使用FlowJo軟件 (Tree Star, Ashland, OR, USA) 進行分析。

1.6 Transwall試驗檢測細胞的侵襲數(shù)量 用不含血清的DMEM將接種5×104/200 μL HEC-1B和Ishikawa細胞在Transwell室上部。 下腔室充滿500 μL 10%FBS EMEM。孵育24 h后，將下腔室中的細胞固定在95%乙醇中，然后用蘇木精染色。在倒置顯微鏡下計算細胞的侵襲數(shù)量。

1.7 微管形成試驗觀察微管樣結(jié)構形式情況 將 Matrigel 人工基質(zhì)膠稀釋后平鋪于 24 孔板的孔底，5×104/ 200 μL HEC-1B和Ishikawa細胞接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h，每隔 4 h 觀察微管樣結(jié)構形成情況。用倒置顯微鏡下隨機拍照(100×)，采用 Microvision Saisam 軟件分析微管形成結(jié)節(jié)數(shù)。

1.8 試劑盒檢測細胞ROS、8-OHdG、ATP和線粒體超氧化物的表達水平 用藥物處理1×104/孔的細胞24 h。 根據(jù)制造商的說明書，使用ATPlite發(fā)光測定試劑盒(美國Perkin Elmer)測量ATP水平。 ROS使用CM-H2DCFDA(美國利弗技術公司)檢測含量。 將細胞與10 μM CMH2DCFDA(Life Technologies，US)在37℃孵育1 h。 使用Spectramax M5酶標儀在ex/em為495/525 nm下測量吸光度。 使用DNEasy Mini Kit(Qiagen)提取DNA。 按照制造商的規(guī)程，使用OxiSelect氧化性DNA損傷ELISA試劑盒(Cell Biolabs)對8-OHdG進行了定量。 在Spectramax M5上讀取吸光度酶標儀在450 nm。

2 結(jié)果

2.1 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞活性的影響 隨著羅哌卡因濃度的增加，HEC-1B和Ishikawa 細胞活性明顯下降；隨著培養(yǎng)時間增加，HEC-1B和Ishikawa細胞活性逐漸下降，見圖1。我們選擇藥物濃度1 mM，作用時間48 h作后續(xù)實驗。

圖1 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞活性的影響

2.2 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞增殖和凋亡的影響 細胞克隆形成試驗結(jié)果表明，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞增殖降低(P<0.01)。流式細胞術結(jié)果表明，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞凋亡增加(P<0.01)，見圖2。

圖2 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞增殖和凋亡的影響

2.3 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞侵襲的影響 Transwall試驗檢測HEC-1B和Ishikawa細胞的侵襲結(jié)果表明，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞侵襲降低(P<0.01)，見圖3A。Western blot 檢測相關侵襲相關蛋白的表達量，與對照組相比，E-cadherin蛋白表達量顯著上調(diào)，而Vimentin蛋白表達量顯著下調(diào)在HEC-1B和Ishikawa 細胞(P<0.05)，見圖3B。

圖3 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞侵襲的影響

2.4 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞微管形成的影響 微管形成試驗檢測結(jié)果表明檢測HEC-1B和Ishikawa細胞微管形成結(jié)果表明，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞微管形成數(shù)降低(P<0.01)，見圖4A。Western blot 檢測相關細胞微管形成相關蛋白的表達量，與對照組相比，VEGF蛋白表達量顯著下調(diào)在HEC-1B和Ishikawa 細胞(P<0.05)，見圖4B。

圖4 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa細胞微管形成的影響

2.5 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞氧化損傷的影響 試劑盒檢測HEC-1B和Ishikawa細胞中ROS、8-OHdG、ATP和線粒體超氧化物的表達水平。結(jié)果表明，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa細胞中ROS、 8-OHdG 和線粒體超氧化物的表達水平顯著增加，ATP的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 羅哌卡因?qū)EC-1B和Ishikawa 細胞氧化損傷的影響

3 討論

有研究表明，局麻藥在減少癌癥復發(fā)和改善癌癥患者整體生存中的有益作用可能是由于其對癌細胞的直接抑制作用[15]；其可影響患者圍術期、預后及術后轉(zhuǎn)移和復發(fā)，還與腫瘤患者免疫功能相關[16-17]。臨床前研究表明，局部麻醉藥通過抑制癌細胞功能的多個方面，如生長、存活、遷移和侵襲等對癌細胞具有活性[18-19]。研究報道羅哌卡因顯著降低了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細胞的活力[20]。羅哌卡因切口局部浸潤麻醉聯(lián)合靜脈自控鎮(zhèn)痛(PCIA)對肝癌肝切除術患者術后鎮(zhèn)痛效果明顯，縮短住院時間,加速術后康復，同時不加重肝腎功能的損傷，安全性較好[21]。

羅哌卡因通過調(diào)控miR-520a-3p的表達，進而抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲，并進一步抑制WEE1和PI3K/AKT信號通路[22]。羅哌卡因通過調(diào)節(jié)整合素 α2 (integrin α-2 ，ITGA2)的表達來抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、侵襲、遷移和促進細胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞增殖降低 ，而HEC-1B和Ishikawa 細胞凋亡增加，與李福祥[14]研究一致。

E-cadherin是一種單通道跨膜蛋白，介導同性細胞和細胞間的相互作用。E-cadherin介導的細胞-細胞粘附和整合素介導的周圍細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)接觸的粘附有協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)，而這些信號調(diào)節(jié)癌細胞定向遷移和侵襲[24]。波形蛋白(Vimentin)是中間纖維蛋白家族的主要組成部分，在正常間質(zhì)細胞中廣泛表達，并被認為能夠維持細胞的完整性和抵抗應激。波形蛋白在各種上皮性癌癥中過度表達，包括前列腺癌、宮頸癌、胃腸道腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、惡性黑色素瘤和肺癌。波形蛋白在腫瘤中的過表達與腫瘤生長、侵襲和預后不良密切相關[25]。在本研究中，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞侵襲降低。與對照組相比，E-cadherin蛋白表達量顯著上調(diào)，而Vimentin蛋白表達量顯著下調(diào)在HEC-1B和Ishikawa 細胞，與李福祥[14]的研究一致。

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor ，VEGF)是一種同型二聚糖蛋白，分子量約為45 kDa，是新血管形成的關鍵介質(zhì)，并與兩個VEGF receptor-1和VEGF receptor-2結(jié)合，在血管內(nèi)皮細胞上表達。在健康人群中，VEGF促進胚胎發(fā)育中的血管生成，并在成人的傷口愈合中發(fā)揮重要作用。VEGF是癌癥血管生成的關鍵介質(zhì)，在腫瘤中其受到癌基因表達、多種生長因子和缺氧的影響而上調(diào)[26]。研究表明，聯(lián)合檢測生長抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)和VEGF對子宮內(nèi)膜癌預后的評估有一定臨床意義[27]。反復給予羅哌卡因和羅哌卡因負載脂質(zhì)體和能量限制可通過降低晚期癌痛小鼠VEGF-A水平而持續(xù)緩解癌痛[28]。在本研究中，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa 細胞微管形成數(shù)降低。與對照組相比，VEGF蛋白表達量顯著下調(diào)在HEC-1B和Ishikawa 細胞。

研究表明羅哌卡因促進ROS和8-OHdG的產(chǎn)生，且其通過鈉通道無關的線粒體功能障礙和氧化應激抑制腫瘤血管生成[29]。羅哌卡因促進線粒體超氧化物的表達水平，抑制ATP的表達水平，且羅哌卡因通過干擾線粒體功能對乳腺癌有抑制作用[30]。在本研究中，與對照組相比，羅哌卡因藥物處理HEC-1B和Ishikawa 細胞后，HEC-1B和Ishikawa細胞中ROS、 8-OHdG 和線粒體超氧化物的表達水平顯著增加，ATP的表達水平顯著降低。

4 結(jié)論

羅哌卡因抑制HEC-1B和Ishikawa 細胞增殖，侵襲及微管形成，并促進細胞凋亡和氧化損傷，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供臨床依據(jù)。