劉 曉 桐，孫 欣 宇，劉 玥，王 一 惠，劉 冰 南

(大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有很強的抗氧化性能[1-3]。與化學合成的蝦青素相比，天然蝦青素更加安全、易利用[4-6]。法夫酵母作為目前最主要的天然蝦青素來源之一，具有發(fā)酵條件簡單、易于高密度培養(yǎng)、生長周期較短等特點[7-9]。野生型紅法夫酵母含30～100 μg/g的類胡蘿卜素，其中90%為蝦青素，但蝦青素的總產(chǎn)量低，同時菌種的發(fā)酵溫度較低(20 ℃)等因素限制了其工業(yè)生產(chǎn)的可能性[10-12]。王立梅等[13]采用析因設(shè)計法、中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析法使得蝦青素產(chǎn)量從5.89 μg/mL提高到10.9 μg/mL。鄭蕾等[14]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖和葡萄糖分別是紅法夫酵母生長和積累蝦青素的最佳碳源；在最佳氮源組成的情況下，蝦青素的產(chǎn)量達到6.78 mg/L。因此，提高法夫酵母的發(fā)酵溫度和蝦青素的產(chǎn)量、降低成本成為當前的研究熱點。

本試驗以在25 ℃下可以生長且產(chǎn)蝦青素的突變菌株XD-YB作為出發(fā)菌株，使用亞硝基胍(NTG)作為誘變劑，對法夫酵母進行誘變[15]。后使用二苯胺(DPA)作為篩選劑，篩選出一株性狀穩(wěn)定、高產(chǎn)蝦青素的突變菌株——法夫酵母X-NTG-25。為確定最佳發(fā)酵工藝條件，以蝦青素為指標，采用響應(yīng)面法對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化[16]，以期得到蝦青素產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)基成分和條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株：紅法夫酵母(XD-YB)，實驗室前期誘變獲得的耐熱菌株。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基

1.2 方 法

挑取斜面上的菌株至裝有50 mL新鮮PDA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，置于25 ℃、180 r/min的恒溫搖床，培養(yǎng)36～48 h至對數(shù)生長期。

1.2.1 蝦青素質(zhì)量分數(shù)的測定

采用冰凍-酸-熱法[17]提取蝦青素。試驗重復(fù)3次，直至菌體顏色變白，上清液過濾膜待測。

采用高效液相色譜法測定蝦青素含量[18]。色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 nm×5 μm)；檢測器，紫外UV檢測器；檢測波長，478 nm；進樣量，20 μL；體積流量，1 mL/min；柱溫為室溫。

流動相A，90%甲醇；流動相B，10%乙腈。

洗脫條件：90% A和10%B，0 min；50% A和50% B，20 min；100% A，71 min。

采用直接干燥法測定菌體的生物量[198]。

1.2.2 誘變方法

采用20 μg/mL亞硝基胍對紅法夫酵母誘變處理20 min，僅5%～10%細胞存活，用0.1 mol/L pH 7.0檸檬酸緩沖液洗滌，于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，再涂布于含有40 μmol/L二苯胺的PDA固體平板上，25 ℃培養(yǎng)。待平板上長出紅色菌落，即為二苯胺抗性菌落。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化法夫酵母的發(fā)酵條件

1.2.3.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用用PB試驗，有效地將關(guān)鍵因素挑出來。選擇發(fā)酵條件中的6個因素作為考察對象，試驗次數(shù)N=12，高水平和低水平因子分別編碼為“1”和“-1”進行試驗。

1.2.3.2 中心組合設(shè)計

根據(jù)PB試驗得出的關(guān)鍵因素作為響應(yīng)面的3個因素。采用Design-Expert軟件中的CCD組合設(shè)計法確定發(fā)酵條件的試驗方案。以各試驗單因素最優(yōu)取值點為中心，上下區(qū)域各取1個水平值作為響應(yīng)面試驗設(shè)計水平。因子分別編碼為-1.682、-1、0、1和1.682，中心點試驗次數(shù)為20。根據(jù)相應(yīng)的CCD試驗方案進行試驗后，對試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸模型的擬合，得到合適的回歸方程[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變篩選二苯胺抗性菌株

二苯胺是酵母類胡蘿卜素合成抑制劑，會使紅酵母喪失合成色素的能力而使菌落呈現(xiàn)淡黃色或者白色，因此可以篩選出高產(chǎn)蝦青素的法夫酵母菌株[21]。在誘變培養(yǎng)基上挑選出變紅的抗性菌落至液體搖瓶進行搖瓶發(fā)酵。經(jīng)篩選，蝦青素質(zhì)量分數(shù)超過200 μg/g的菌株有3株。

2.2 遺傳穩(wěn)定性驗證

3株菌經(jīng)連續(xù)傳代5次，檢測菌株每一代的蝦青素產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1號和2號誘變株都出現(xiàn)了產(chǎn)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，蝦青素產(chǎn)量下降率較大，而菌株X-NTG-25產(chǎn)量穩(wěn)定，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，菌株X-NTG-25的每一代產(chǎn)量變化不超過6%，表明這株誘變菌株的蝦青素產(chǎn)量相對穩(wěn)定，且蝦青素產(chǎn)量達到213.94 μg/g，較出發(fā)菌株的蝦青素產(chǎn)量提高了52%。

表1 突變菌株的穩(wěn)定性鑒定Tab.1 Stability identification of mutant strains

2.3 Plackett-Burman設(shè)計

研究了6種發(fā)酵條件對法夫酵母中蝦青素積累的影響，這6種條件都是在單因素試驗中對蝦青素產(chǎn)量有顯著影響的因素，設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman

對回歸方程進行方差分析，揭示因子和響應(yīng)值的關(guān)系，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，自變量和因變量具有顯著相關(guān)性(P=0.024 7<0.05)，表明線性回歸方程是擬合的。X1，X4，X5的P<0.05，表明Fe2+濃度、溫度和轉(zhuǎn)速的效果顯著。

表3 各因素水平及顯著性分析效應(yīng)值Tab.3 Prominent analysis of factor levels and effect value

2.4 蝦青素產(chǎn)量的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

2.4.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

以Fe2+濃度、轉(zhuǎn)速和溫度3個因子作為考察對象，通過中心組合試驗設(shè)計了三因素五水平的試驗，記錄每組因素組合的試驗結(jié)果，并將試驗結(jié)果填入對應(yīng)列，結(jié)果見表4。

表4 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 Design and results of central composed experiments

采用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合，得到以蝦青素為目標函數(shù)的二次回歸方程：

Y=268.46-16.80A-19.16B+1.9C+

16.52AB-4.31AC+7.81BC-

36.44A2-43.71B2-35.55C2+

32.04A2B+42.69AB2+26.19A2B2

2.4.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程預(yù)測不同條件對法夫酵母產(chǎn)蝦青素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，模型響應(yīng)值最大時的最佳條件為轉(zhuǎn)速195.59 r/min、溫度21.99 ℃、Fe2+濃度1.51 μmol/L?？紤]到實際操作因素，確定法夫酵母的發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速195 r/min、溫度22 ℃、Fe2+濃度1.51 μmol/L。

2.4.3 法夫酵母發(fā)酵最佳條件的確定和驗證

為了確定模型的準確性(回歸方程)并驗證優(yōu)化結(jié)果，在最佳的培養(yǎng)條件下重復(fù)試驗3次。得到法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的預(yù)測值和試驗值分別為272.58和(279.89±9.53)μg/g，誤差僅為2.7%。蝦青素實際產(chǎn)量與模型預(yù)測值非常契合，比初始條件下的產(chǎn)量提高了30.8%。與已有研究結(jié)果相比，本結(jié)果在蝦青素研究中屬于中等水平[4-5]，但能在25 ℃下進行發(fā)酵，為后續(xù)試驗提供一個出發(fā)菌株。

(a)轉(zhuǎn)速和Fe2+濃度

3 結(jié) 論

通過化學誘變法得到了遺傳穩(wěn)定且高產(chǎn)的法夫酵母突變株X-NTG-25。采用PB設(shè)計分析了轉(zhuǎn)速、溫度、接種量、Fe2+濃度、K+濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度6種因素對法夫酵母蝦青素產(chǎn)量的影響，篩選出3個影響顯著因子。中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速、溫度和Fe2+濃度三因素對蝦青素產(chǎn)量影響最大。優(yōu)化得到的法夫酵母X-NTG-25發(fā)酵最佳條件為轉(zhuǎn)速195 r/min、溫度22 ℃、Fe2+濃度1.5 μmol/L。在最佳條件下，蝦青素產(chǎn)量為279.89 μg/g，與出發(fā)菌株相比提高了98.9%。