2.暨南大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學影像中心(廣東 廣州 510630)

3.廣州市人民醫(yī)院放射科(廣東 廣州 510630)

高 鵬1 劉于寶1 劉灶松3 史長征2 羅良平2,*

目前，R2＊mapping技術已經(jīng)成為一種可靠又無創(chuàng)性評價活體組織內(nèi)鐵含量的有效工具，它可以敏感地檢測到體內(nèi)鐵含量變化所致的局部磁環(huán)境的改變。組織內(nèi)的鐵沉積產(chǎn)生的順磁效應通過縮短T2＊，從而影響組織的R2＊，該技術在國外應用已接近成熟。Kuhlpeter等[1]研究發(fā)現(xiàn)R2＊mapping技術具有更強的R2效應，尤其是用于測量細胞內(nèi)少量鐵沉積時更加突出，這些發(fā)現(xiàn)得到了Bowen等[2]研究結(jié)果的支持。Wang等[3]應用磁共振跟蹤和量化超順磁性氧化鐵(superparamgnetic iron oxide，SPIO)標記的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在體外和體內(nèi)的歸巢的研究中發(fā)現(xiàn)，R2＊值與組織內(nèi)載鐵細胞數(shù)量呈線性相關。R2＊mapping具有較好的組織橫向弛豫率，雖然在探測不同形式的鐵方面特異性不強，但在探測生物組織內(nèi)鐵含量具有極高的敏感性[4]。此外，R2＊mapping技術不易受到MR設備和操作因素差異的影響[5]。

本研究選用F/A-PLGA@DOX/SPIO納米載藥體系為暨南大學生命技術科學院自主研發(fā)，已申請研究專利，首次應用于腫瘤以及動物實驗研究，該納米體是以高分子聚合物材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)為載體，裝載阿霉素(doxorubicin,DOX)以及SPIO，通過在PLGA表面修飾利用葉酸(folic acid，F(xiàn)A)和可活化細胞穿膜肽(activatable cell penetrating peptide，ACPP)作為雙重探針，制備出腫瘤微環(huán)境響應和FR-受體介導的雙靶向納米體系。有關該納米體系的制備、細胞水平上生物活性研究及抗腫瘤活性等研究成果前期已進行報道[6]。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作雄性裸鼠24只，由暨南大學實驗動物中心提供[動物許可證號：SYXK(粵)2017-0174]。A549細胞在恒定的條件下(37℃,5%CO2)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，待細胞貼壁生長穩(wěn)定后，PBS清洗后加入胰酶消化，重懸細胞懸液傳代培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期，消化收集腫瘤細胞，用預冷PBS稀釋調(diào)整細胞密度為3×107個/mL，抽取0.2mL/只的量接種于4～5周齡的BALB/C裸鼠右后肢根部，常規(guī)無菌飼養(yǎng)，一周后即可成瘤，腫瘤橫徑約5～8mm。每天觀察裸鼠成瘤情況并記錄裸鼠體重及瘤體大小，至腫瘤塊長成試驗所要求大小。

1.2 試驗分組在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)皮下移植瘤直徑約8～10mm，腫瘤均以實質(zhì)成分為主，未見明顯的囊變壞死區(qū)域。NSCLC裸鼠移植瘤模型24只，隨機分為G1、G2兩組，每組12只。每組進行MR基態(tài)掃描，掃描結(jié)束后給藥。G1組給予單純SPIO(5mg/kg)；G2組給予F/A-PLGA@DOX/SPIO(5mg/kg)，所有藥造影均采用尾靜脈給藥。

1.3 MRI 檢查采用GE 1.5T超導臨床核磁成像系統(tǒng)(SignaHDxt，Milwaukee，WI)和動物專用小鼠線圈。麻醉后將裸鼠固定在專用動物線圈上，將移植瘤的中心定位于線圈及磁體的中央。對全部裸鼠皮下移植瘤模型進行常規(guī)MRI檢查及R2＊掃描檢查，檢查時間點取給藥前基態(tài)(base)和給藥后3、12、24、48、60h。各掃描序列及參數(shù)：(1)快速自旋回波T1WI:FSE序列，TR 660.0ms，TE 14.7ms，矩陣256×192，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)5.0cm×5.0cm，激勵次數(shù)(NEX)2，回波鏈長(ETL)2個，帶寬(bandwidth)10.00kHz，進行軸位掃描。(2)快速自旋回波T2WI:FSE序列，TR2620.0ms，TE 80.0ms，矩陣256×192，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)5.0cm×5.0cm，激勵次數(shù)(NEX) 2，帶寬(bandwidth)10.00kHz，回波鏈長(ETL)為14個，進行軸位掃描。(3)多次快速梯度回波R2＊序列：TR235ms，TE為44.2～107.7ms(16個TE)，矩陣192×128，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描視野(FOV)6.0cm×4.8cm，激勵次數(shù)(NEX)為1，帶寬(bandwidth)31.25kHz，翻轉(zhuǎn)角(flip angle)20°。采用CE ADW4.5圖像后處理工作站進行，采用Functool軟件包測量R2＊值，擬合常規(guī)圖像與偽彩圖，感興趣區(qū)域(ROI)的選取以T2WI和b=0時的圖像為參照，盡量避開明顯壞死液化區(qū)，同時應避免測及瘤體邊緣和偽影干擾區(qū)域，ROI包括瘤體面積的80%以上，各時間點所選ROI的層面和位置盡量保持一致，測量腫瘤相鄰的3個層面并取均值。

1.4 病理學檢查MR掃描結(jié)束后處死全部裸鼠，取出全部腫瘤組織及肝臟、脾臟，在10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，普魯士藍染色，染色后的切片通過光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，G1組與G2組之間采用重復測量資料的方差分析比較不同時間點、對比劑以及兩者之間的交互效應對各組R2＊值的顯著性。組內(nèi)不同時間點的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行兩兩比較，采用()來表示，經(jīng)過F檢驗，若方差齊采用LSD檢測，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)MR表現(xiàn)與基態(tài)相比，G2組在給藥后的60h內(nèi)，不同時間點腫瘤大小、體積均未見明顯改變。兩組裸鼠皮下NSCLC移植瘤信號較均勻，腫瘤均以實質(zhì)成分為主，未見明顯囊變壞死區(qū)域，在常規(guī)T1WI呈等信號，T2WI呈等低信號，中央見少許高信號混雜信號區(qū)。

2.2 磁共振R2＊成像結(jié)果采用平行G1組的重復測量試驗的方差分析進行組間因素(不同時間點)、組內(nèi)×組間因素、組間因素差異的統(tǒng)計學檢驗，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示(表1)：各組不同時間點之間R2＊值總體變化具有統(tǒng)計學差異(F=24.411，P=0.000)；時間與藥物之間不存交互效應(F=1.423，P=0.255)；不同時間點組間比較存在顯著性差異(F=5.720，P=0.007)。兩組不同時間點R2＊值結(jié)果，base點兩組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，其余兩組間各時間點R2＊值差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。裸鼠NSCLC移植瘤T2WI及R2＊值偽彩圖見圖1。

2.3 病理學檢查由圖2可知，裸鼠腫瘤、肝臟、脾臟組織內(nèi)可見較多的藍染顆粒；裸鼠腫瘤普魯士藍染色顯示腫瘤組織中央?yún)^(qū)域聚集較多藍色鐵沉積，且越靠外的區(qū)域鐵沉積越少。F/A-PLGA@DOX/SPIO組腫瘤組織的藍色鐵沉積高于SPIO組，而肝臟、脾臟組織的藍色鐵沉積低于SPIO組。

3 討 論

早期磁共振對于組織及器官內(nèi)鐵沉積的研究，主要集中運用自旋回波序列(spin echo,SE)T2＊成像技術，T2＊值可以很好地反映組織內(nèi)磁敏感對組織信號的影響，且采集時間短、呼吸運動偽影較少[7]。為了方便反映鐵含量的大小，引入了R2＊值，計算公式為R2＊=1000/T2＊。當組織含鐵量增加時，順磁性的鐵化合物會破壞局部磁場的均勻性，導致其周圍氫質(zhì)子的馳豫時間縮短，引起組織的弛豫率R2(1/T2)與R2＊(1/T2＊)增加。R2＊mapping成像速度快，信噪比高，避免使用對比劑，因此極大地縮短掃描時間的同時，可以獲得較高的圖像質(zhì)量?；诖殴舱馬2＊mapping技術可以計算出R2＊值，已有研究證實組織內(nèi)的鐵含量與R2＊值存在高度的相關性[8-10]。本研究主要探討R2＊mapping示蹤F/A-PLGA@DOX/SPIO納米載藥體系在NSCLC腫瘤成像中的應用價值及影像學基礎。

表1 各組不同時間點R2＊值比較(×10-3mm2/s)

圖1 裸鼠NSCLC移植瘤T2WI及R2*值偽彩圖。1A：圓圈示測量時ROI的放置位置；1B：裸鼠移植瘤常規(guī)T2WI圖像；1C：基態(tài)時，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1D：給藥后3h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1E：給藥后24h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖；1F：給藥后60h，裸鼠移植瘤R2*值偽彩圖。圖2 裸鼠病理學圖片。2A、2B分別為G1、G2組腫瘤普魯士藍染色(×20)；2C、2D分別為G1、G2組肝臟普魯士藍染色(×20)；2E、2F分別為G1、G2組脾臟普魯士藍染色(×20)。

本研究結(jié)果顯示，相對于G1組，G2組在給藥后3 h時腫瘤R2＊值上升趨勢明顯，且G2組給藥后60h時腫瘤R2＊值下降幅度明顯低于G1組，組間比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。G1組各時間點R2＊值總體升高幅度較G2組低。單純SPIO容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)吞噬，大部分囤積在肝臟、脾臟等臟器，部分存留在腫瘤組織，病理普魯士藍染色檢查結(jié)果與之一致。本研究中，G2組具有FA和ACPP雙靶性的優(yōu)勢，能夠有效逃離網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)的吞噬，納米粒子在腫瘤內(nèi)留置的時間相對更久。DOX經(jīng)過靶向納米化修飾后不僅明顯提高了腫瘤細胞對藥物的吸收效率，還使靶向納米化藥物F/A-PLGA@DOX/SPIO在正常細胞和腫瘤細胞之間具有選擇性，其主要原因是在A549細胞與正常細胞膜表面FA受體[11]以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/MMP-9的表達水平不同所致。Ross等[12]測得卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、翠丸絨毛膜癌、結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、肺癌等來源于上皮組織的癌組織中葉酸受體亞型(FR-)高度表達，較正常組織高出100～300倍。FA可以特異性識別惡性腫瘤細胞表面過度表達的FR-[11,13]。ACPP可以特異性識別在多種惡性腫瘤細胞中顯著表達的MMP-2/MMP-9[14]，從而發(fā)揮其細胞穿膜功能。在本研究中，成功制備了FA和ACPP雙靶向納米體系用于特異性識別A549細胞膜表面過表達的FR-受體及MMP-2/MMP-9，從而顯著增加納米體系的主動靶向性，明顯提高了藥物的吸收效率。Kuhlpeter等[1]對人肺癌細胞應用單純SPIO與受體靶向修飾SPIO兩種對比劑對比研究發(fā)現(xiàn)，由于后者具有一定的靶向性特點，具有更高的R2＊值，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，G2組腫瘤在給藥24h時R2＊值達到或接近峰值，明顯高于SPIO組。Suzuki等[15]將針對腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體作為主動靶向工具，通過靜脈注射進入荷瘤裸鼠體內(nèi)后，磁性納米粒子在腫瘤部位蓄積量在24～48h時達到最高，與本研究結(jié)果一致。單純SPIO組僅依靠腫瘤的高通透性和滯留(EPR)效應，被動聚集于腫瘤部位，因此R2＊值相對較低。王慶國等[16]發(fā)現(xiàn)R2＊值與SPIO標記的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)濃度呈線性相關，磁共振R2＊成像能夠定量示蹤SPIO標記的EPCs。在體外試驗中，Kircher等[17]發(fā)現(xiàn)R2＊值與SPIO標記的細胞數(shù)呈明顯正相關。以上研究印證了本試驗中G2組腫瘤細胞SPIO蓄積相對較多，導致R2＊值增高的結(jié)論。

利用磁共振技術監(jiān)測組織內(nèi)磁性納米粒子沉積的動物試驗早有報道，但多集中在測量T2信號值。研究表明，在注射靶向性磁性納米藥物1h后就會產(chǎn)生T2信號值的降低[18-20]，本試驗中G2組腫瘤R2＊值在早期就有所改變，呈現(xiàn)上升趨勢，與前期的研究結(jié)果相一致。有研究證明，R2＊值可以作為生物標志物對腫瘤血管靶向藥物及血管抑制劑(vascular disrupting agents，VDA)療效進行監(jiān)測[21-22]，在注射藥物7min后就顯示R2＊值有所減低，在給藥后24h時顯示明顯減低，表明腫瘤內(nèi)血紅蛋白水平的改變與R2＊值之間敏感性較高，這也間接印證了本研究結(jié)果，R2＊值與腫瘤組織內(nèi)鐵含量的改變極其敏感，并在早期有所改變。

本研究中，普魯士藍染色結(jié)果顯示，G2組腫瘤組織的陽性染色率明顯高于G1組，而肝臟、脾臟組織的陽性染色率明顯低于G1組。SPIO是容易被巨噬細胞吞噬或者集中在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)而被清除，而本研究合成的納米體系有效降低網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)的清除，提高納米體系在腫瘤組織的蓄積。這主要是因為本研究納米體系利用PLGA對SPIO進行表面功能化，可以增加對網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞系統(tǒng)及巨噬細胞的逃逸能力，提高其在體內(nèi)的循環(huán)時間，此外，F(xiàn)A和ACPP的靶向修飾進一步提高納米載體的主動識別功能，更加有利于藥物在腫瘤內(nèi)的吸收。本試驗應用病理普魯士藍染色對納米體系在裸鼠腫瘤以及各組織器官分布情況進行鐵的定性分析，染色結(jié)果與R2＊成像結(jié)果相互驗證。

但本研究也存在一定的局限性：(1)樣本量不足，未做到各個影像檢查時間點與病理結(jié)果平行對照，提高兩者之間的相關性；(2)磁共振數(shù)據(jù)后處理中，ROIs的選取會對測量結(jié)果產(chǎn)生一定影響，需要仔細對比解剖圖像，多次測量取平均值才能保證數(shù)據(jù)的相對穩(wěn)定可靠。如果后處理可以采用自動選擇三維全瘤容積數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，避免人為操作產(chǎn)生的誤差，能夠明顯提高定量參數(shù)測量的穩(wěn)定性以及試驗的精確性。

綜上可知，R2＊值與腫瘤組織內(nèi)的SPIO含量存在較高敏感性，R2＊mapping技術提供了一種SPIO的腫瘤示蹤成像方法。