杜 浩 ,李宗鍇 ,只佳增,周勁松,張建春,陳偉強， 岳建偉 *

1云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所，云南 河口 661300； 2開遠市國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園管理委員會，云南 開遠 661600

香蕉枯萎病，又稱香蕉巴拿馬病，是香蕉毀滅性、系統(tǒng)性維管束病害。病原菌為尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf.sp.cubense)，按寄主類型共分為4個生理小種，其中，4號生理小種(Foc TR4)在我國南方香蕉主產(chǎn)區(qū)為害最重(李朝生等，2012)。目前，香蕉枯萎病還沒有一種可完全根治的方法，選育抗(耐)枯萎病品種被認為是最有效的途徑之一。對香蕉種質(zhì)的抗枯萎病評價已有很多研究，但各種評價方法不統(tǒng)一，評價標準也不一致。如:陳厚彬等(2006)在4號生理小種枯萎病發(fā)生嚴重的田間測試了15份香蕉種質(zhì)的抗性，結(jié)果表明,6份為抗,5份中抗,4份感病，未發(fā)現(xiàn)有高抗種質(zhì)；劉以道等(2008)采用苗期盆栽傷根灌菌液的方法測定了36份香蕉種質(zhì)對枯萎病4號生理小種的抗性，結(jié)果表明，13份為中抗,22份為感病,1份為高感，未發(fā)現(xiàn)有高抗種質(zhì)；謝子四等(2009)通過苗期與田間相結(jié)合的評價方法，測定了10份香蕉種質(zhì)對枯萎病4號生理小種的抗性，結(jié)果顯示,3份為高抗,4份抗,3份中抗，未發(fā)現(xiàn)感病種質(zhì)。

云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所香蕉研究團隊先后選育了“紅研1號”“紅研2號”“紅研3號”“紅研5號”“滇蕉1號”等品質(zhì)優(yōu)、特異性強的新品種，其中一些品種在推廣種植中表現(xiàn)出較好的枯萎病抗性能力，但還未經(jīng)過抗性評價試驗明確其抗性水平。本研究立足于云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所目前已獲得授權(quán)的自主品種，利用PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法、PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液浸根法、無菌水孢子懸浮液灌注法3種接種方法，在3個孢子濃度下，進行香蕉枯萎病抗性評價方法的篩選，并評價7個香蕉品種的抗性水平，以期為自主香蕉品種的應(yīng)用推廣提供試驗數(shù)據(jù)支持，同時為香蕉枯萎病的抗性評估研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試香蕉品種 生長一致的7個品種(巴西蕉、南天黃、紅研1號、紅研2號、紅研3號、紅研5號、滇蕉1號)香蕉組培苗。其中，“南天黃”為市場購買，其他品種為云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所組培中心提供。用營養(yǎng)袋裝入約0.8 kg的無菌土，移栽組培苗，正常水肥管理，待香蕉苗長至5～6片葉時，選取長勢良好、大小一致的無病苗用于試驗，并分別在各幼苗的營養(yǎng)袋上噴涂油漆以標記品種。

1.1.2 病原菌的鑒定與保藏 尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種(Foc TR4)病原菌，由云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所香蕉團隊在云南省河口瑤族自治縣香蕉枯萎病發(fā)病植株上采集并分離，病原菌的鑒定工作由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所黃貴修研究員、楊洋博士協(xié)助完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種方法和接種濃度的篩選 選取已開展過相關(guān)抗性評價的高感品種巴西蕉(黃素梅等，2019)、中抗品種紅研2號(楊智梅等，2019)、高抗品種南天黃(許林兵等，2017)為材料，研究苗期抗性評價方法。

PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法：將Foc TR4菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，取直徑0.6 cm的菌餅接種于PDB培養(yǎng)基中，27 ℃、搖床暗培養(yǎng)6～7 d后，用4層紗布過濾掉菌絲，使用血球計數(shù)板計算出病菌孢子濃度，然后加無菌PDB培養(yǎng)基配制成2×104、2×105、2×106個·mL-13個濃度的病菌孢子懸浮液備用。接種時用小刀割傷香蕉少量根系，并接種相應(yīng)濃度病原菌5 mL，每個品種香蕉接種15株，重復4次。

無菌水孢子懸浮液灌注法(左存武等，2010)：將Foc TR4菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上大量培養(yǎng)，28 ℃、暗培養(yǎng)10 d至長滿整個培養(yǎng)皿，用無菌水將孢子沖洗下來，并用4層紗布過濾掉菌絲，用血球計數(shù)法計算孢子濃度，加無菌水配制成2×104、2×105、2×106個·mL-13個濃度的的病菌孢子懸浮液備用。接種時用小刀割傷香蕉少量根系，并接種相應(yīng)濃度病原菌5 mL，每個品種香蕉接種15株，重復4次。

PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液浸根法：取香蕉袋裝苗，去除營養(yǎng)袋，輕輕剝除根際土壤，剪斷少量根系，然后浸入孢子濃度為2×104、2×105、2×106個·mL-1的PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液中，60 min后取出，重新移栽到營養(yǎng)袋中。

1.2.2 7個香蕉品種的苗期抗性評價 根據(jù)1.2.1結(jié)果，篩選最佳接種方法和接種濃度用于7個香蕉品種的苗期抗性評價試驗。按篩選的最佳接種方法接種40 d后，調(diào)查香蕉苗發(fā)病情況，并分別根據(jù)表1、2進行苗期病害分級和抗性評價(李朝生等,2012； 謝子四等，2009)?？剐栽u價時，根據(jù)葉片癥狀和球莖癥狀得到的抗性級別不一致時，以“大”等級(抗性差者)作為該品種的抗性級別。

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算發(fā)病率及病情指數(shù)(嚴重度)。發(fā)病率/%=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100；嚴重度=∑(各級級別數(shù)×該級別株數(shù))/調(diào)查總株數(shù)。

表2 香蕉苗期抗性評價標準

1.3 田間抗性評價

1.3.1 試驗地選取與試驗方法 試驗地位于云南省河口縣南溪農(nóng)場馬肚白隊(103.544° E，22.384° N，海拔290 m)，前作香蕉枯萎病發(fā)病率約60%。選取南天黃、紅研1號、紅研2號、紅研3號、紅研5號、滇蕉1號共6個品種，每個品種80株，標記后隨機混合并種植在試驗地中。香蕉定植后每4個月調(diào)查一次，分別記錄發(fā)病率和死亡率，香蕉死亡或發(fā)病不進行補苗(避免補苗對后期調(diào)查工作造成干擾)，持續(xù)調(diào)查2代蕉。

1.3.2 田間抗性評價標準 枯萎病的田間診斷標準為：植株下部葉片黃化2片以上或假莖基部有2塊以上葉鞘開裂且裂縫長度大于10 cm記為病株。根據(jù)收蕉前最后一次調(diào)查的香蕉死亡率作為田間抗性評價依據(jù)(黃素梅等，2014)，抗性評價標準參考黃秉智等(2005)分為高抗HR(死亡率<10%)、抗病R(10%≤死亡率<20%)、中抗MR(20%≤死亡率<40%)、感病S(40%≤死亡率<60%)、高感HS(死亡率≥60%)5個等級。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel 2003和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方法和接種濃度的篩選

以球莖癥狀嚴重度作為發(fā)病嚴重度的標準，測定了3種接種方法在3個接種濃度下的抗性評價結(jié)果。結(jié)果表明(表3)：隨Foc TR4孢子濃度的升高,各品種香蕉病害嚴重度均增加；3種接種方法中，以無菌水孢子懸浮液灌注法病害嚴重度最低，PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液浸根法病害嚴重度最高，PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法結(jié)果居中。在香蕉品種的抗性評價工作中，考慮到無菌水孢子懸浮液灌注法發(fā)病嚴重度較低，PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液浸根法病害嚴重度最高，但接種時，需要將香蕉根系全部拔出，在PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液中浸泡后再移栽，程序相對繁瑣，所以在接種方法上，建議選擇發(fā)病嚴重度居中的PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法；而對于接種濃度的選擇，在本研究中，使用2×105個·mL-1的PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法，2個對照品種的抗性評價結(jié)果與已報道的南天黃為高抗(許林兵等，2017)、巴西蕉為高感(黃素梅等，2019)基本一致，建議選用接種濃度為2×105個·mL-1。

表3 接種方法和接種濃度對苗期抗性評價的影響

2.2 7個香蕉品種的苗期抗性評價

采用濃度2×105個·mL-1的PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法對7個香蕉品種進行苗期抗性評價，結(jié)果表明：南天黃、紅研3號為高抗，紅研2號、紅研5號、滇蕉1號為中抗，巴西蕉、紅研1號為高感，其中，紅研2號和紅研5號球莖與葉片癥狀確定的抗性級別不一致，選用抗性級別較“大”者(抗性較差者)作為最終評價結(jié)果(表4)。

表4 7個香蕉品種苗期抗性評價

2.3 6個香蕉品種田間抗性評價

測定6個香蕉品種的田間抗性(表5)，結(jié)果表明：第1造蕉，發(fā)病率從高到低依次為巴西蕉(65.0%)>滇蕉1號(61.1%)>紅研2號(32.5%)>紅研5號(22.5%)>紅研3號(12.5%)>南天黃(5.8%)；死亡率從高到低依次為巴西蕉(58.3%)>滇蕉1號(37.8%)>紅研2號(25.0%)>紅研5號(18.3%)>紅研3號(12.5%)>南天黃(4.2%)。根據(jù)死亡率得到抗性水平為：南天黃為高抗，紅研3號、紅研5號為抗病，紅研2號、滇蕉1號為中抗，巴西蕉為感病。

表5 6個香蕉品種的田間抗性評價

第2造蕉相比第1造蕉，所有香蕉品種的發(fā)病率和死亡率均升高；發(fā)病率從高到低依次為巴西蕉(91.7%)>滇蕉1號(87.5%)>紅研2號(46.4%)>紅研5號(32.5%)>紅研3號(20.0%)>南天黃(11.7%)；死亡率從高到低依次為巴西蕉(85.0%)>滇蕉1號(51.3%)>紅研2號(37.3%)>紅研5號(29.2%)>紅研3號(16.7%)>南天黃(9.2%)；根據(jù)死亡率得到抗性水平為：南天黃為高抗，紅研3號為抗病品種，紅研2號和紅研5號為中抗，滇蕉1號為感病，巴西蕉為高感。

3 討論

本研究通過PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法、PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液浸根法、無菌水孢子懸浮液灌注法3種接種方法，在2×104、2×105、2×106個·mL-13個濃度下，篩選香蕉種質(zhì)苗期抗性評價最簡便可行的方案。通過比較接種后的病害嚴重度發(fā)現(xiàn)，隨接種孢子濃度的升高香蕉病害嚴重度增加，3種接種方法中，建議選擇2×105個·mL-1的PDB培養(yǎng)基孢子懸浮液灌注法更為高效可行。

苗期抗性評價試驗結(jié)果顯示，南天黃、紅研3號為高抗，紅研2號、紅研5號、滇蕉1號為中抗，巴西蕉、紅研1號為高感。而田間抗性評價結(jié)果表明：第1造蕉，南天黃為高抗，紅研3號、紅研5號為抗病，紅研2號、滇蕉1號為中抗，巴西蕉為感??；第2造蕉，南天黃為高抗，紅研3號為抗病，紅研2號和紅研5號為中抗，滇蕉1號為感病，巴西蕉為高感。苗期與田間抗性評價結(jié)果不盡一致，苗期抗性評價結(jié)果受到蕉苗大小、接種方法、接種濃度等因素的影響；而在田間抗性評價中，隨著種植年限的增加，本研究中第2造蕉抗性評價結(jié)果明顯低于第1造蕉，且田間抗性評價結(jié)果受土壤Foc TR4孢子濃度、田間水肥管理措施、當?shù)貧夂驐l件等多種因素的影響。所以香蕉種質(zhì)的抗性評價應(yīng)對各種因素作綜合考量,以確定抗性標準。

在本研究中，綜合苗期和田間抗性評價結(jié)果，7個香蕉品種的抗性由高到低為：南天黃>紅研3號>紅研5號>紅研2號>滇蕉1號>巴西蕉>紅研1號(紅研1號未開展田間抗性評估，僅以苗期抗性評價為依據(jù))，具體抗性評價為南天黃為高抗，紅研3號和紅研5號為中等抗性偏強，紅研2號達到中抗水準，巴西蕉和紅研1號為高度感病。需要加以說明的是,在苗期抗性評價中，根據(jù)球莖和葉片癥狀嚴重度,滇蕉1號均被評價為中抗水平，但球莖癥狀嚴重度(2.95)和葉片癥狀嚴重度(1.87)分別接近于中抗和感病的抗性評價臨界值(3.0和2.0)；同時在田間抗性評價中，根據(jù)死亡率得到的抗性水平滇蕉1號第1造蕉為中抗，第2造蕉為感病，但相對于本研究中的其他品種，滇蕉1號表現(xiàn)出發(fā)病率遠高于死亡率，所以僅以死亡率作為田間抗性評價的依據(jù)是不夠全面準確的，考慮以上因素，本研究中滇蕉1號抗性評價為感病。