李莉莉， 謝瑞祺， 王 莉， 劉友德， 鄧麗霞， 鄒志強， 秦 松

(1. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，煙臺 264003；2. 山東省煙臺市奇山醫(yī)院，煙臺 264001；3. 河海大學(xué) 海洋學(xué)院，南京 201198；4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，青島 266071)

人類的腸道中含有大量的微生物。健康的腸道微生物群落形成天然的防御屏障，保證宿主免疫、營養(yǎng)等正常生理代謝的運行。且已有研究表明腸道菌群的多樣性與乙型肝炎、肝硬化和肝細胞癌等密切相關(guān)[1]。

腸道菌群的改變在誘導(dǎo)和促進肝臟疾病的發(fā)展中扮演重要角色。肝硬化可引起腸道內(nèi)革蘭氏陰性腐敗菌(如大腸桿菌)大量繁殖，進而引起菌群失調(diào)，抑制乳桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的正常繁殖[4]。在大鼠模型中，肝硬化大鼠腸桿菌科豐度較高[5]。在對藏族肝硬化患者腸道微生物的研究中，肝硬化患者中擬桿菌門含量顯著減少，厚壁菌門和放線菌門增加；葡萄球菌屬、放線菌屬顯著減少，乳桿菌屬顯著增加[6]。肝硬化患者體內(nèi)與口腔相關(guān)的微生物如韋榮氏球菌屬(Veillonella)和鏈球菌屬(Streptococcus)等，會產(chǎn)生易位現(xiàn)象，在腸道中繁殖[7]。此外，肝硬化患者菌群失調(diào)會導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥，如菌血癥和肝性腦病，并伴有小腸細菌過度生長和腸通透性增加[8]。盡管已有一些肝臟疾病與腸道微生物的研究，但對肝硬化患者特征腸道微生物的研究較少。本研究通過肝硬化患者的生化指標(biāo)和腸道微生物組學(xué)的聯(lián)合分析，解析肝損傷與患者的特征腸道菌群的相關(guān)性，為肝硬化的精準(zhǔn)醫(yī)療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集了12例肝硬化(CIR)患者糞便及血液樣本以及11名無慢性疾病或胃腸道疾病史的健康志愿者(CN)作為對照。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：過去3～6個月內(nèi)使用抗生素或飲酒，有胃腸手術(shù)史，有其他肝營養(yǎng)性病毒(HAV、HCV、HEV)或HIV感染史，生活方式不健康。本研究方案和實施過程嚴格遵循“赫爾辛基宣言”的倫理標(biāo)準(zhǔn)及世界衛(wèi)生組織與國際醫(yī)學(xué)科學(xué)組織理事會共同制定的《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究國際倫理準(zhǔn)則》。

1.2 試驗方法

1.2.1 生化指標(biāo)檢測

使用自動生化分析儀(貝克曼LX-20，美國富勒頓)測定血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ谷?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、總膽汁酸(TBA)、白細胞(WBC)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、甘油三酯(TG)、凝血國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)、極低密度脂蛋白(VLDL)和高靈敏度C反應(yīng)蛋白(HsCRP)的水平。

1.2.2 腸道微生物16S rRNA基因測序分析

于清晨用一次性采樣勺采集受試者新鮮糞便樣本，迅速冷凍于-80℃冰箱，進行后續(xù)測序分析。采用CTAB/SDS法提取糞便樣本總基因組DNA。利用特異性引物(16S V4: 515F-806R)擴增16S rRNA基因。所有PCR反應(yīng)均使用Phusion?高保真PCR Master Mix(New England Biolabs)進行，在Illumina HiSeq 2500平臺上對文庫進行測序。16S rRNA測序數(shù)據(jù)采用微生物生態(tài)學(xué)平臺(Quantitative Insights Into Microbial Ecology platform，QIIME)定量分析(V.1.9.1)。以97%的相似性臨界值選擇操作分類學(xué)單位(OTUs)。利用序列最少的樣本對應(yīng)的序列號標(biāo)準(zhǔn)對OTUs豐度信息進行歸一化處理。對每個有代表性的序列，根據(jù)RDP分類器算法(Version 2.2，http:∥sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)的GreenGene數(shù)據(jù)庫(http:∥greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)進行分類信息標(biāo)注。利用Wilcoxon秩和檢驗評價組間類群的豐度差異。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性檢驗。采用R包對所有菌群數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(V.2.15.3)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0進行生化指標(biāo)的分析。CIR及CN兩組間差異采用one-way ANOVA及Bonferroni-Holm事后檢驗法進行分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P值小于0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CIR與CN組生化指標(biāo)分析

肝硬化患者血清中ALT、AST、GGT、ALP、TBIL和INR水平均高于對照組，其中GGT、TBIL、TBA和INR水平與對照組差異顯著(P<0.05)，表明與對照組相比，CIR組肝損傷程度增加(圖1)；INR延長可反映肝功能不全、門脈高壓兩大失代償期肝硬化病理生理特征[9]。GGT與肝內(nèi)合成亢進或膽汁排出受阻，及擠壓肝細胞數(shù)量、受壓強度密切相關(guān)，GGT水平的升高也反映了肝功能的異常[10-11]。CIR組CHOL、LDLC、HDLC、ALB和WBC水平均低于對照組，血清中ALB和WBC水平顯著低于健康對照組(P<0.05)，ALB、WBC等是代表性肝功能指標(biāo)，表明CIR組患者肝功能的下降(圖1)。CIR組HsCRP整體離散很大，導(dǎo)致誤差較大。

(a)血清ALT、AST、GGT、ALP、ALB、TBIL及TBA水平組間差異；(b)WBC、GLU、CHOL、LDLC、HDLC、TG、INR、VLDL 及HsCRP水平差異。CIR為肝硬化組，CN為對照組。* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。圖1 血液生化指標(biāo)分析Figure 1 Blood biochemical indicators

2.2 CIR組與CN組腸道微生物豐度差異

在門水平上，肝硬化患者腸道中厚壁菌門及變形菌門豐度低于對照組，擬桿菌門豐度高于對照組[圖2(a)]。在科水平上，肝硬化患者擬桿菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科豐度最高，與對照組相比，CIR組患者腸道中擬桿菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科水平上差異不大，略低于對照組；普雷沃氏菌科、韋榮氏菌科豐度高于對照組[圖2(b)]。

(a)門水平；(b)科水平。CIR為肝硬化組，CN為對照組。圖2 腸道微生物的差異性分析Figure 2 Differences in gut microbial abundance at the phylumand family levels

2.3 屬種水平組間差異顯著性分析

在屬水平上，CIR組布勞特氏菌屬、罕見小球菌屬豐度顯著低于對照組，普雷沃氏菌屬、瘤胃菌科UCG-014屬豐度顯著高于對照組[圖3(a)]。在種水平上，CIR組中普雷沃氏菌、瘤胃菌科UCG-014菌被顯著富集，瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌豐度顯著降低[圖3( b)]。

2.4 腸道微生物與生化指標(biāo)相關(guān)性分析

選取CIR患者屬水平上總豐度排名前20的腸道微生物與生化指標(biāo)進行相關(guān)性分析，其中普雷沃菌屬與INR、GGT、TBA水平顯著正相關(guān)；與ALB水平顯著負相關(guān)；瘤胃菌科UCG-014屬豐度與INR及GGT水平顯著正相關(guān)。布勞特氏菌屬與INR、TBA、TBIL、GGT水平顯著負相關(guān)，與ALB水平顯著正相關(guān)。瘤胃球菌屬2與TBA、INR水平顯著負相關(guān)，且與WBC水平顯著正相關(guān)(圖4)。選取種水平上總豐度排名前20中與GGT等生化指標(biāo)具有相關(guān)性的腸道微生物(共11個物種)進行分析，其中普雷沃氏菌9、瘤胃菌科UCG-014菌及瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌與對照組差異顯著[圖3(b)]；且普雷沃菌屬9、瘤胃菌科UCG-014菌與INR、TBA、GGT顯著負相關(guān)，與ALB水平顯著正相關(guān)；瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌與INR、TBA、GGT、TBIL水平顯著負相關(guān)，與ALB水平顯著正相關(guān)。CIR患者腸道中普雷沃菌屬9、瘤胃菌科UCG-014屬及布勞特氏菌屬豐度與對照組差異顯著(P<0.05)，且與INR、GGT等肝損傷相關(guān)生化指標(biāo)關(guān)系密切，可能在肝硬化疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，在肝硬化預(yù)后診斷中有著重要的臨床意義。

(a)屬水平；(b)種水平。CIR為肝硬化組，CN為對照組。* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。圖3 腸道微生物差異分析Figure 3 Differences in gut microbial abundance at the genus and species levels

* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。圖4 腸道微生物與血液生化指標(biāo)相關(guān)性分析Figure 4 Correlation analysis of bacterial genera and bloodbiochemical indicators

3 討論

生化分析結(jié)果顯示CIR組TBIL和TBA水平顯著上升，這與周麗等[12]對肝硬化患者血清生化指標(biāo)的研究一致。ALB、WBC水平顯著下降(圖1)，與韋麗梅等[13]對病毒性肝炎、肝硬化患者生化指標(biāo)的研究一致。與健康對照組相比，在CIR患者中觀察到INR、GGT水平顯著上升(圖1)，反映患者肝損傷程度。

腸道微生物組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：在門水平上，CIR組厚壁菌門豐度較低[圖2(a)]，與失代償期肝硬化患者的腸道微生物特征研究一致[14]，且擬桿菌門豐度較高；在科水平上，CIR普雷沃氏菌科、韋榮氏球菌科水平顯著高于對照組[圖2(b)]，與Shao等[15]對肝硬化患者腸道微生物特征的觀點一致；在屬水平上，肝硬化患者普雷沃菌屬豐度顯著上升[圖3(a)]。研究表明，普雷沃菌是潛在致病菌，可能與其促炎作用相關(guān)[16]。體外實驗顯示，Prevotellacopri可以刺激IL-6、IL-23和IL-17等與促炎Th17反應(yīng)相關(guān)的細胞因子。在右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，感染了普雷沃菌屬P.copri的小鼠炎癥反應(yīng)增加[17]；與宿主炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。P.copri也被認為是非酒精性脂肪肝(NAFLD)兒童患者腸道微生物中，與晚期肝纖維化相關(guān)的主要菌種[18]。且相關(guān)性分析表明，普雷沃菌屬9與INR、GGT、TBA水平顯著正相關(guān)，與ALB水平顯著負相關(guān)，與肝損傷程度密切相關(guān)。同時，瘤胃菌科UCG-014屬豐度較對照組顯著增加。Boursier等[19]發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬豐度的增加與纖維化F2期之間有一定相關(guān)性，且瘤胃球菌可以作為NAFLD患者肝纖維化的獨立預(yù)測因子。且瘤胃菌科UCG-014屬與GGT、INR等肝損傷指標(biāo)顯著相關(guān)(圖4)。

我們還發(fā)現(xiàn)在CIR患者中，布勞特氏菌屬豐度顯著下降。布勞特氏菌是重要的醋酸鹽生產(chǎn)菌，而醋酸鹽是腸道微生物對肝部脂肪酸β氧化的主要刺激物，布勞特氏菌下調(diào)則會影響肝部的生理功能[6]，還可幫助清除腸道中的氣體；在人體腸道內(nèi)有發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)的能力，對人體健康發(fā)揮積極作用[21]。結(jié)果顯示肝硬化患者罕見小球菌屬豐度顯著下降，且該菌屬與ALB水平顯著相關(guān)。在利福昔明用藥后肝硬化程度改善的患者中發(fā)現(xiàn)罕見小球菌屬豐度的增加[22]。罕見小球菌屬可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸可通過抑制腸道炎癥反應(yīng)，減輕微生物細胞成分或其他代謝產(chǎn)物等對肝臟造成的損傷[23]。此外，肝硬化患者瘤胃球菌屬2的豐度較對照組顯著下降。Wang等[24]對消瘦型肝硬化前期患者的腸道微生物分析發(fā)現(xiàn)，瘤胃球菌屬的豐度較對照組降低3倍。

腸道微生物的改變會直接使其代謝產(chǎn)物含量的變化，這些改變可以直接或間接改變肝臟的生理活動。在種水平上，CIR組瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌豐度顯著下降 [圖3(b)]。瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌也可產(chǎn)生短鏈脂肪酸[25]，間接影響肝臟能量代謝[26]、緩解肝損傷程度[23]等。此外，瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌產(chǎn)生的D-阿洛酮糖3-差異異構(gòu)酶(DPEase)可將D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖，且D-阿洛酮糖對宿主生理健康有積極的作用[27-28]。相關(guān)性分析表明，瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌與INR、TBA、GGT、TBIL水平顯著負相關(guān)，與ALB水平顯著正相關(guān)(表1)。證明了瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌與肝損傷程度的相關(guān)性。

表1 種水平腸道微生物與生化指標(biāo)相關(guān)性

綜上所述，肝硬化會導(dǎo)致肝臟生化指標(biāo)異常及腸道中的菌群失調(diào)，肝硬化組中普雷沃氏菌屬，布勞特氏菌屬，瘤胃菌科UCG-014屬，罕見小球菌屬，瘤胃球菌屬5 1 39BFAA菌與健康組的差異顯著，且這些菌與肝硬化患者的肝損傷程度相關(guān)。