聶傳朋， 陳丹丹， 李焰焰

(武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，武夷山 354300)

福建有悠久的茶樹種植歷史，經(jīng)過不斷的雜交和自交，茶樹資源豐富[1]。但也因?yàn)椴粩嗟淖越缓碗s交，這些茶樹骨干親本相似，親緣關(guān)系密切，遺傳背景較窄[2]。DNA條形碼在系統(tǒng)分類學(xué)中應(yīng)用越來越廣泛。利用特定的DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析植物的系統(tǒng)發(fā)生和遺傳變異，為物種鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了重要依據(jù)[3]。matK基因是DNA條形碼識(shí)別的核心序列，廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育和遺傳結(jié)構(gòu)分析[4]。matK基因引物通用性差，研究在前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)成功的前提下，通過matK部分序列對(duì)采自武夷學(xué)院茶樹種質(zhì)資源圃(始建于2015年，面積80畝約5.33 km2)引種于福建省5個(gè)地區(qū)的51個(gè)茶樹品種樣本遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，了解資源圃內(nèi)福建茶樹的遺傳背景，為武夷學(xué)院茶樹種質(zhì)資源圃建設(shè)及福建茶樹的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

51個(gè)茶樹品種樣本均采集武夷學(xué)院茶樹種質(zhì)資源圃，按照原產(chǎn)地分成5個(gè)群體(表1)。還有原產(chǎn)自建陽和永春的茶樹資源各1種。將新鮮采摘的福建茶種放在密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用其嫩葉提取DNA。將嫩葉洗凈晾干后，放入冰凍過的研缽中，經(jīng)液氮研磨，至粉末狀后將轉(zhuǎn)移到離心管中[5]。

1.2 茶樹DNA提取

選擇Plant Genomic DNA試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)對(duì)新鮮采摘的51個(gè)福建茶種提取總DNA[6]。所有離心步驟均使用臺(tái)式高速離心機(jī)，在室溫下進(jìn)行離心。提取的總DNA, 采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[7]。將收集的DNA溶液置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

表1 福建茶樹品種及單倍型信息表

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物為matKKIM_3F(5′-CGTACAGTCTTTTGTGTTTACGAG-3′)和matKKIM 1R(5′-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3′)[8]。PCR擴(kuò)增體系: 12 μL ddH2O，15 μL PCR Master Mix，matKKIM_3F/1R 引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂凝膠糖上電泳檢測(cè)， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行單向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Chromas軟件查看序列峰圖，ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，通過人工校正除去兩端不能用的序列，保存成fasta格式和mega格式。利用MEGA 7.0軟件計(jì)算序列之間的突變位點(diǎn)的堿基組成頻率，使用Kimura-2 參數(shù)模型計(jì)算群體間和群體內(nèi)遺傳距離。將序列比對(duì)后的fasta格式文件導(dǎo)入Dnasp 5軟件，計(jì)算51個(gè)茶樹序列的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性(Hd)、核酸多樣性(Pi)、遺傳分化系數(shù)(Fst)[9]。依據(jù)(1-Fst)/(4Fst)≈Nm的公式求出基因流(Nm)。使用MEGA 7.0軟件的鄰接法(NJ)構(gòu)建單倍體系統(tǒng)發(fā)育樹，所有的空位做缺失處理，使用鄰接法(NJ)進(jìn)行分析，為檢測(cè)鄰接樹中每個(gè)分支的支持率，使用自舉法進(jìn)行1 000次計(jì)算[10]。應(yīng)用Dnasp 5軟件對(duì)所有樣本進(jìn)行中性檢驗(yàn)Tajima’s D、Fu and Li’D* and F*及錯(cuò)配分布曲線[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳圖結(jié)果見圖1(截取了10個(gè)品種)，設(shè)置陰性對(duì)照，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出條帶，與Marker對(duì)比可知，福建茶種均獲得清晰的800 bp左右的目的條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。

2.2 序列特征和單倍型分布

51個(gè)福建茶樹序列比對(duì)后，獲得的序列長度為833 bp，其中堿基A/T/C/G的組成頻率為36.9%、30.3%、15.8%和17.0%。51個(gè)品種序列共定義了7個(gè)單倍型(表1和表2)，單倍型多樣性(Hd)為0.525，核苷酸多樣性(Pi)為0.001 89。其中，常見單倍型有Hap1和Hap3；稀有單倍型有Hap2、Hap4、Hap5、Hap6和Hap7。來自福鼎、永春和建陽原產(chǎn)地的茶樹樣本少，因此只檢測(cè)到一種單倍型。而來自武夷山原產(chǎn)地茶樹樣本多，擁有的單倍型數(shù)最多。在單倍型的分布中，7種單倍型頻率差異較大，頻率分別為64.7%(Hap1)、1.96%(Hap2)、25.5%(Hap3)、1.96%(Hap4)、1.96%(Hap5)、1.96%(Hap6)和1.96%(Hap7)。Hap1出現(xiàn)的頻率最高，說明Hap1單倍型較為穩(wěn)定。表2中顯示了這7種單倍型之間的26個(gè)多態(tài)變異位點(diǎn)。

圖1 部分?jǐn)U增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測(cè)電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis for partial amplification products

表2 基于matK部分序列的單倍型多態(tài)位點(diǎn)

2.3 單倍體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

MEGA軟件構(gòu)建的鄰接樹(圖2)，有四大分支，均有較高的自展支持率。Hap2、Hap5和Hap1形成第一進(jìn)化枝，自展支持率為62%，有較近的親緣關(guān)系。第二進(jìn)化枝由Hap6和Hap7組成，具有較高自展支持率83%。Hap3和Hap4單獨(dú)為一個(gè)進(jìn)化枝,說明Hap3和Hap4與其他單倍型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 群體遺傳距離

應(yīng)用MEGA 7.0軟件選擇Kimura-2 參數(shù)模型檢測(cè)遺傳距離，結(jié)果(表3)顯示，不同茶樹兩兩群體之間的遺傳距離范圍是0.000 3～0.003 3，群體內(nèi)遺傳距離范圍是0.000 0～0.003 7。最大值存在于武夷山與政和茶樹群體之間，遺傳距離為0.003 3，說明武夷山與政和茶樹群體親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳分化程度大，遺傳多樣性高。最小值存在福安和福鼎茶樹群體之間，遺傳距離為0.000 3，說明福安和福鼎茶樹群體親緣關(guān)系近，遺傳分化程度小，遺傳多樣性低。不同茶樹群體內(nèi)，遺傳距離最小是福鼎茶樹，遺傳距離最大的是政和茶樹。

圖2 基于matK部分序列的福建茶樹的NJ發(fā)育樹Figure 2 NJ development tree of Fujian tea trees based on matK partial sequence

表3 群體間(對(duì)角線下)和群體內(nèi)(對(duì)角線上)遺傳距離

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)與分化

通過分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)福建茶樹群體間分化系數(shù)Fst=-0.016 22～0.500 00和基因流Nm=-15.663 07～15.210 73(表4)。安溪和福鼎茶樹群體之間存在高度分化(Fst>0.25)，地理隔離產(chǎn)生分化(Nm<1)。福安和安溪、福鼎茶樹群體；安溪和政和茶樹群體間均為低度分化(0.054)；福安和政和茶樹群體間基因交流頻率高(Nm>4)。

表4 福建茶樹群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)(Fst對(duì)角線下)和基因流(Nm對(duì)角線上)

2.6 中性檢驗(yàn)與錯(cuò)配分布分析

福建茶樹的matK序列的Tajima’s D、Fu and Li’D* and F*中性檢驗(yàn)呈現(xiàn)明顯偏離，且達(dá)到顯著水平(Tajima’sD=-2.392 771，P<0.01；Fu and Li’sD*=-4.576 21,P<0.02；Fu and Li’sF*=-4.523 57,P<0.02)，錯(cuò)配分布曲線呈現(xiàn)為單峰模式(圖3)，表明福建茶樹群體可能經(jīng)歷了擴(kuò)張事件，顯著偏離了穩(wěn)定群體。

實(shí)線代表期望值，虛線代表觀察到的堿基差異分布。圖3 錯(cuò)配分布曲線Figure 3 Mismatch distribution curve

3 討論與結(jié)論

單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量遺傳變異的重要指標(biāo)，能很好地反映物種的遺傳多樣性水平[12]。研究共檢測(cè)到7種單倍型，單倍型多樣性為0.525，核苷酸多樣性為0.001 89。與核苷酸多樣性相比，單倍型多樣性相對(duì)較高，出現(xiàn)這種情況可能是瓶頸反應(yīng)后茶樹群體擴(kuò)張的原因。少量堿基突變能迅速增加單倍型多樣性，但很難在短期內(nèi)積累較多的核苷酸變異。Hap2、Hap4、Hap5、Hap6和Hap7為稀有單倍型，出現(xiàn)在福安、武夷山、政和和永春地區(qū)。政和、福鼎和永春地區(qū)茶樹樣本少，檢測(cè)到的單倍型少。Hap1和Hap3為常見單倍型，表明這兩個(gè)單倍型相對(duì)穩(wěn)定。研究表明，植物DNA單倍體多樣性(hd)的平衡值為0.67，表明51個(gè)福建茶樹的單倍型多樣性(Hd=0.525)水平低于平均值，從一定程度上說明福建茶種的遺傳多樣性是較低的[13]。

遺傳距離、遺傳分化系數(shù)和基因流是衡量群體多態(tài)性的重要參數(shù)。51個(gè)福建茶樹樣本根據(jù)原產(chǎn)地分為5個(gè)群體；永春和建陽茶樹樣本數(shù)量各1個(gè)，不能構(gòu)成群體，不能反映出永春和建陽地區(qū)的遺傳距離、遺傳分化系數(shù)和基因流。

遺傳距離表明群體間或個(gè)體間的遺傳區(qū)別，它是探究遺傳多樣性的前提，也可以反映群體間演化過程[14]。武夷山與其他4個(gè)茶樹群體間的遺傳距離(0.001 5～0.003 3)大于這4個(gè)茶樹群體兩兩之間的遺傳距離(0.000 3～0.002 5)；福安與福鼎茶樹群體間的遺傳距離為0.000 3；福安與政和茶樹群體間的遺傳距離為0.002 2；福安與福鼎茶樹群體親緣關(guān)系較近，而與政和茶樹群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過分析種群內(nèi)及種群間遺傳多樣性分析，可以為資源圃內(nèi)的茶樹引種提供參考。

遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)表征群體間遺傳分化程度。當(dāng)Fst介于0～0.05，群體間差異?。划?dāng)Fst介于0.05～0.15，群體間分化程度低；當(dāng)Fst介于0.15～0.25，說明群體間分化程度中等；當(dāng)Fst大于0.25時(shí)，表明群體間分化程度高[15]。當(dāng)Nm大于4，表明群體隨機(jī)交配；當(dāng)Nm小于1,表明群體可能朝著遺傳分化的方向發(fā)展。武夷山與安溪、福鼎、政和茶樹群體間Fst均小于0.05，Nm均大于4，表明武夷山與這3個(gè)茶樹群體之間遺傳分化很小，基因交流頻繁。福安與福鼎茶樹群體間的Fst為0.107 41，Nm為2.083 40，表明福安和福鼎茶樹群體之間存在低度分化，有不同程度的交流。福安與政和茶樹群體間Fst為0.016 17，Nm為15.210 73，表明福安和政和茶樹群體之間無差異并隨機(jī)交配。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因：一方面可能與茶樹栽培的選育方法有關(guān)，除自然條件外不同群落的遷移和雜交，骨干親本相似；也存在人工引種使不同地區(qū)的茶樹不斷雜交，不同群體的茶樹基因交流頻繁，群體親緣關(guān)系密切[16]。另一方面，在實(shí)驗(yàn)期間，茶樹的樣本數(shù)量因地區(qū)而異，對(duì)茶樹群體結(jié)構(gòu)和遺傳分化的研究在一定程度上被削弱。

通過福建茶樹兩兩序列變異的中性檢驗(yàn)及錯(cuò)配分布曲線分析結(jié)果表明，福建茶樹群體在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了群體擴(kuò)張。出現(xiàn)擴(kuò)張事件的原因可能是經(jīng)過長期的育種栽培，一些有良好品質(zhì)的福建茶樹被大規(guī)模種植，遺傳多樣性降低。