高 婷, 朱 瑜, 趙 晨, 葛 燕, 李端華, 李進軍, 王 輅

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052)

核酸酶是以核酸為底物，催化磷酸二酯鍵水解的一類酶。核酸酶按作用底物的不同分為脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和非特異性核酸酶；按作用的位點不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。其中非特異性核酸內(nèi)切酶是一類高活性水解酶，其最大的特點是能非特異地降解幾乎所有類型的核酸，包括單鏈、雙鏈、線狀及環(huán)狀的 DNA 和 RNA，且對核酸的序列沒有嚴格的要求[1]。目前關(guān)于非特異性核酸酶的報道已經(jīng)很多，例如：海洋嗜熱細菌噬菌體(GBSV1-NSN)非特異性核酸酶[2]，對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)核酸酶[3]，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocoliticasubsp.palearctica)核酸酶[4]，靈桿菌(Escherichiacoli)非特異性核酸酶[5]等。非特異性核酸內(nèi)切酶已在工業(yè)、醫(yī)藥及分子研究等各領(lǐng)域得到非常普遍的應(yīng)用，如工業(yè)上消除生物制品中的外源核酸，減少過敏反應(yīng)[6-7]，醫(yī)藥上可以作為抗腫瘤藥物的輔助增效試劑[8]，在分子研究中可用于抗病毒試劑的開發(fā)[9]等。非特異性核酸內(nèi)切酶已有商品化的產(chǎn)品Benzonase，主要用途是在蛋白質(zhì)純化的過程中消除核酸的污染，加入該核酸酶可以減小加工處理過程中蛋白樣品的黏稠度[10]。目前關(guān)于非特異性核酸酶的酶活測定方法主要有3種方法：王亞楠[11]通過瓊脂糖凝膠電泳檢測非特異性核酸酶活性，以RNA為底物，在70 ℃水浴15 min的RNA的減少來反映酶活性；Song等[12]采用分光光度法測量非特異性核酸酶活性，以DNA為底物，在60 ℃孵育15 min，單位時間內(nèi)使Δ260值增加0.001所需的酶量來表示酶活大小，此方法需要以高氯酸等強酸來終止反應(yīng)，且受溶液中雜質(zhì)影響較大；第3種方法是改進的原位染色法[13-14]，此方法是在12%分離膠中加入DNA，利用SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，電泳后將凝膠用溴化乙錠染色，通過凝膠記錄系統(tǒng)酶活性可視化為一條條帶，操作條件較為復(fù)雜。因此為研究非特異性核酸酶，建立快速準確的非特異性核酸酶酶活測定方法非常重要。

本酶活測定方法原理是非特異性核酸酶能促使核酸降解為單磷酸核苷酸，未被降解的DNA與瓊脂糖凝膠中的Gelred核酸染料結(jié)合后形成一種熒光絡(luò)合物(Gelred-DNA復(fù)合物)，在312 nm紫外光的照射下會發(fā)出較強的熒光，這種熒光可用帶 CCD 成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝，利用Quantity one分析軟件分析拍攝的圖像即得到核酸條帶的光密度值。核酸被非特異性核酸酶降解后，核酸的光密度值會降低，故通過光密度值的變化來鑒定非特異性核酸酶的作用。比光密度值為核酸減少的光密度值與核酸總量的光密度值的比值，反映了非特異性核酸酶水解核酸的能力，在一定條件下與酶活性有良好的線性關(guān)系，故利用一定條件下單位時間內(nèi)比光密度值的變化來表示非特異性核酸酶的酶活力。本文研究了多種因素對核酸酶酶活測定的影響，并進行方法驗證，以期建立一種簡便、快速、準確的非特異性核酸酶活性檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備

Bio-Rad凝膠成像儀ChemiDoc XRS及分析軟件Quantity One購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 試劑和工作液

20 mmol/L Tris 緩沖液：20 mmol/L Tris，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L NaCl，HCl調(diào)pH值至8.0；6×蔗糖DNA Loading Buffer：10 mmol/L Tris(pH 7.6)，60 mmol/L EDTA，40% 蔗糖(W/V)，0.05% 溴酚藍(W/V)；DNA底物母液(20 μg/μL)：稱取0.5 g 鮭魚精子DNA，溶于25 mL 20 mmol/L Tris緩沖液，2個當(dāng)量的NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，保存于-20 ℃；1×TAE緩沖液：40 mmol/L Tris-乙酸鹽，1 mmol/L EDTA， pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定方法

制膠：稱取1.0 g 瓊脂糖，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，于微波爐加熱至溶解，冷卻至60 ℃加入10 μL Gelred染色液，并搖勻。倒入制膠板中，室溫冷卻凝固。

取甲、乙兩支0.5 mL 離心管，分別設(shè)定為陰性對照管與測定管，在每支離心管中分別加入0.1 μg/μL 的DNA底物溶液36 μL ，在37 ℃預(yù)熱5 min，甲管中加入20 mmol/L Tris 緩沖液 2 μL，乙管中加入2 μL 稀釋酶液，立即混勻，在37 ℃反應(yīng)3 min后，立即加入7.6 μL 6×蔗糖DNA Loading Buffer混勻，冰浴，終止反應(yīng)。取樣10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于100 V電泳25 min。將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像儀工作臺，選擇透射UV光，調(diào)節(jié)圖像至清晰，進行曝光采集圖像。用Quantity One打開采集的圖像，識別條帶并扣除背景值，即分析得到各條帶的光密度值。

酶活力單位：在37 ℃，pH 8.0的條件下， 38 μL的體系中以濃度為0.1 μg/μL的核酸為底物，1 min內(nèi)使核酸的1% 瓊脂糖凝膠電泳比光密度值減少1%的酶量定義為1個活性單位。

酶活力計算：

ATO(列車自動運行)通過監(jiān)測列車能量來預(yù)測所有的安全定位，并使列車盡可能靠近安全限制點。為了達到此目的，ATO計算得到能量觸發(fā)曲線，并在給定時間內(nèi)對曲線的估計進行優(yōu)化以及更改。安全限制點的主要類別包括永久速度限制(如土建限速)、臨時速度限制(如臨時限速)、零速度目標(biāo)速度、占用的軌道電路或計軸邊界、線路的末端、車檔、防護區(qū)段、非受控道岔、限制信號和授權(quán)終點等。

X=[(OD對照-OD樣品)/OD對照]×100×Dr/(t×V)

式中：OD對照為陰性對照樣光密度，OD樣品為酶樣光密度，(OD對照-OD樣品)/OD對照表示比光密度值，Dr為稀釋倍數(shù)，t為反應(yīng)時間，min，V為加酶體積，μL。

1.2.2 底物濃度的確定

配制0.025、0.05、0.075、0.1、0.125和0.15 μg/μL的DNA底物溶液，Benzonase核酸酶液稀釋125倍，反應(yīng)3 min，分別按照1.2.1的酶活性測定方法進行酶促反應(yīng)，研究不同底物濃度對反應(yīng)速率的影響。各個DNA底物濃度進行2次平行實驗。

1.2.3 待測酶活范圍的確定

取核酸酶液稀釋不同倍數(shù)(20、40、75、80、100、125、150、200、250和500倍)，配制不同濃度的核酸酶，分別按照1.2.1的酶活性測定方法與0.1 μg/μL脫氧核糖核酸底物進行酶促反應(yīng)，研究不同核酸酶濃度對相應(yīng)酶活力測定的影響。每個稀釋倍數(shù)進行2次平行實驗。

1.2.4 反應(yīng)時間的確定

取180 μL 0.1 μg/μL的 DNA 底物溶液，加入10 μL 125倍稀釋酶液，按照1.2.1的酶活性測定方法進行酶促反應(yīng)，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9和10 min時取樣10 μL，立即加入2 μL的6×蔗糖DNA Loading Buffer，混勻冰浴，取樣10 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳。每個時間進行2次平行實驗。

1.2.5 方法驗證

線性關(guān)系考察。取10支0.5 mL離心管，按照表1配置溶液；精確量取各組分后充分混勻，加入7.6 μL 6×蔗糖DNA Loading Buffer 混勻，取樣10 μL，進行1%瓊脂糖電泳。重復(fù)測定3次，分析各條帶光密度值，制作標(biāo)準曲線。

表1 溶液配置

準確度調(diào)節(jié)。已知含量的核酸酶液，使其濃度分別達到其含量的80%、100%和120%，按照1.2.1酶活性測定方法測定酶活，每個濃度重復(fù)測定3次，分別計算各濃度的樣品回收率(回收率=實際測得值/理論值)和相對標(biāo)準偏差。

精密度。分別量取6份酶液，用20 mmol/L Tris 緩沖液稀釋125倍，按照1.2.1酶活性測定方法測定這6個相同濃度酶液的酶活，考察其相對標(biāo)準偏差。

檢測限與定量限。以水和20 mmol/L Tris分別與核酸底物反應(yīng)，測其光密度值，計算光密度差值，此作為基線。依此計算當(dāng)S/N≥3的光密度差值作為檢測限，當(dāng)S/N≥10的光密度差值作為定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度的確定

在酶活的測定中，酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應(yīng)的速度有很大影響。在底物濃度很低時，由于提供的底物不足，使得酶促反應(yīng)速度很低；隨著底物濃度的增加，酶促反應(yīng)的速度成比例迅速增加；而隨著底物濃度繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開始減慢，到一定程度，反應(yīng)速度趨于恒定為一常數(shù)，實際上就是趨向最大反應(yīng)速度，在此處底物濃度變化，對反應(yīng)速度影響很小[15]。

由圖1可知，底物濃度在0.025～0.1 μg/μL時，酶促反應(yīng)速度隨底物濃度增加而顯著增大，但超過0.1 μg/μL時，變化不顯著，表現(xiàn)為酶已基本被底物飽和，且相對標(biāo)準偏差較大。一般而言，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^大，酶促反應(yīng)速率過高，會導(dǎo)致相對標(biāo)準偏差增大[16]，從圖1可看出，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.1 μg/μL時，相對標(biāo)準偏差最小，因此底物濃度0.1 μg/μL時為最優(yōu)濃度。后續(xù)在非特異性核酸酶酶活力測定采用的底物脫氧核糖核酸濃度為 0.1 μg/μL。

圖1 底物濃度對反應(yīng)速率的影響Figure 1 Effect of substrate concentration on reaction rate

2.2 待測酶活范圍的確定

由于酶促反應(yīng)底物的量是一定的，所以加入的酶液的酶活濃度要在測定線性范圍內(nèi)。結(jié)果如圖2和圖3所示，核酸酶液的酶活在4.17～9.01U/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R2=0.992 7)，酶濃度過高則測定結(jié)果較低，過低超過了檢測限，故在測定酶活時要調(diào)整至該范圍內(nèi)才能準確測定。

圖2 不同酶濃度對酶活測定的影響Figure 2 The influence of different enzyme concentrations on enzyme activities

圖3 不同酶濃度與測得酶活的線性關(guān)系Figure 3 Linear relationship between different enzyme concentrations and measured enzyme activities

2.3 反應(yīng)時間的確定

有研究顯示，即使在適宜條件下酶的催化效率也不是一成不變的，酶催化速率會下降，即酶出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象[16]，比如酶反應(yīng)的產(chǎn)物達到一定濃度后對酶產(chǎn)生反饋抑制作用，故進行酶活力測定，要確定適宜的酶反應(yīng)時間。從酶促反應(yīng)進程曲線可知，反應(yīng)起始一段時間內(nèi)，由于底物充足，底物的變化與時間成直線關(guān)系(其斜率代表初速度)；隨反應(yīng)時間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，反應(yīng)速度下降。因而反應(yīng)速度隨著時間延長會越來越慢，只有反應(yīng)的初速度才與酶量成正比，因此要準確測定出酶活力大小，就應(yīng)在底物過量的情況下在初速度時間內(nèi)測定。得到的酶促反應(yīng)進程曲線如圖4所示：在前3 min，底物的減少量隨反應(yīng)時間呈線性增長，其斜率代表了反應(yīng)的初速度；3 min后，隨反應(yīng)時間的延長，曲線趨于平坦，反應(yīng)速度逐漸減慢。為了保證反應(yīng)處于初速度時間內(nèi)，同時盡量降低實驗操作帶來的影響，最終確定的反應(yīng)時間為3 min。

2.4 線性關(guān)系考察結(jié)果

線性關(guān)系考察結(jié)果見圖5。以DNA底物濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準曲線，并得出回歸方程：y=203 311x+1 128.9，線性相關(guān)性系數(shù)R2=0.994 2。

圖4 酶促反應(yīng)進程曲線Figure 4 Progress curve of enzymatic reaction

圖5 標(biāo)準曲線Figure 5 The linear dependence between different concentrations of DNA substrates and OD value

2.5 準確度試驗結(jié)果

準確度試驗結(jié)果見表2。測得3種濃度樣品回收率為99.63%、98.96%和98.76%，平均RSD為2.09%。

2.6 精密度試驗結(jié)果

通過制備6個相同濃度酶溶液進行測定，精密度實驗結(jié)果見表3。測得樣品之間的相對標(biāo)準偏差為2.3%，小于5%，重復(fù)性較好。

表2 非特異性核酸酶酶活的準確度試驗結(jié)果

表3 非特異性核酸酶活性精密度試驗結(jié)果

2.7 檢測限與定量限

檢測限與定量限測定結(jié)果見表4。核酸底物減少量即光密度差值為3 321.62，此時S/N≥3，定為檢測限。光密度差值為1 1071.05時，S/N≥10，定為定量限。

表4 非特異性核酸酶活性檢測限與定量限試驗結(jié)果

3 討論

目前國家現(xiàn)有的關(guān)于核酸酶的檢測標(biāo)準為《GB/T 34801—2017脫氧核糖核酸酶活力檢測方法》[17]和《GB/T 34222—2017核糖核酸酶活力檢測方法》[18]，這兩種標(biāo)準均采用紫外分光光度法檢測酶活性。紫外分光光度法是根據(jù)核酸降解后在最大吸收波長260 nm的吸光度增加，產(chǎn)生增色效應(yīng)，通過測定單位時間內(nèi)260 nm處吸光度的增加來表示酶活力。該方法操作簡單，重復(fù)性較好，但反應(yīng)時間較長(10 min)且不能同時進行多個樣品的測定。

從實驗結(jié)果可見，本方法適用于低濃度的酶活測定(4.17～9.01 U/μL)，酶與底物用量少大大減少了測定成本。紫外分光光度法的干擾因素較多，凡是能引起A260變化的物質(zhì)如離子、色素均會影響酶活力測定結(jié)果[19]，不適用于成分復(fù)雜或雜質(zhì)較多的酶液酶活性測定，但本方法主要由DNA與染料結(jié)合形成的熒光復(fù)合物在紫外燈的照射下發(fā)出熒光，酶反應(yīng)液中的雜質(zhì)對其影響較小，且在穩(wěn)定的緩沖體系中電泳，反應(yīng)條件溫和，故此方法相較于紫外分光光度法提高了抗干擾能力。兩種方法同時使用可增加酶活力測定范圍，有效彌補了紫外吸收法測定酶活的不足，特別適合于一般實驗室對非特異性核酸酶的測定。本方法反應(yīng)時間短，3 min即可完成反應(yīng)進行測定。反應(yīng)時間的長短，對判斷酶活測定結(jié)果的準確性非常重要，時間過長或過短都會使得測定結(jié)果偏低。本方法靈敏度較高，通過測定空白樣品的光密度差值，計算其三倍信噪比和十倍信噪比時的光密度差值，得出該方法能被檢測的最低濃度非特異性核酸酶活為1.11 U/μL，能被定量測定的最低濃度非特異性核酸酶活為3.71 U/μL。根據(jù)實驗結(jié)果，要使酶活性被準確定量，檢測樣品的酶濃度不得低于定量限，酶濃度也不能過高，過高則超過了該方法的定量范圍。因此，選用此方法進行酶活性測定時，酶濃度要控制在酶活測定范圍內(nèi)，過高或過低都會使得超過定量范圍，致使靈敏度不佳。

本方法由于是測定底物減少量來測定酶活，因此在每一批次均需設(shè)定陰性對照組，這一設(shè)定消除了不同批次間瓊脂糖融化過程的不一致、使用凝膠成像儀的曝光時間及位置不一致以及個人測定習(xí)慣對酶活測定的影響，大大提高了該方法的精確度。

4 結(jié)論

酶活力測定是進行酶研究、生產(chǎn)與應(yīng)用的基礎(chǔ)，探尋一個快速、簡便而且精確的測定方法尤其重要。本方法采用凝膠成像儀測定了底物減少量來測定酶活，重復(fù)性好且測定結(jié)果精確，酶用量少減少了測定成本，反應(yīng)時間大大縮短，而且可同時測定多個樣品的酶活。本研究為非特異性核酸酶的酶活測定提供了一套操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠及高效率的方法。