徐潤宏， 譚 梅， 朱錦福， 劉澤華

(1. 青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，西寧 810008； 2. 青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室，西寧 810008)

氮是陸地生態(tài)系統(tǒng)的限制因素之一。大氣氮沉降的急劇增加給陸地生態(tài)系統(tǒng)造成的不良影響已引起相關(guān)學(xué)者的普遍關(guān)注，如土壤碳氮含量變化，植物生物量及多樣性變化，微生物分解等。

土壤微生物是土壤中最活躍和最豐富的生物類群[1]，是陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)的重要參與者，在土壤氮循環(huán)中起重要作用[2]。研究表明，短期模擬氮沉降條件會使微生物量增加的原因是土壤有效養(yǎng)分含量增加[3]。氮沉降改變了土壤微生物生物量、真菌和細菌的比值，從而使群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。也有研究表明，氮沉降對土壤微生物的生長有抑制作用[5]，但其變化規(guī)律還不明了，需要進一步了解。

青藏高原是全球變化的敏感區(qū)和生態(tài)脆弱區(qū)，在全球生態(tài)系統(tǒng)中居于重要生態(tài)地理位置[6]。在生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用[7-8]。青海湖位于青藏高原東北部，是青海省東北部重要的生態(tài)安全屏障，在維持青藏高原和我國西北部生態(tài)安全平衡等方面具有重要作用[9]。氮沉降背景下有關(guān)高寒濕地土壤微生物的研究還較少，揭示其對氮沉降的響應(yīng)規(guī)律有助于更好地了解氮沉降對高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)的影響，并對生態(tài)系統(tǒng)功能變化提供參考?；诖耍疚耐ㄟ^不同水平氮添加試驗，利用高通量測序技術(shù)測定細菌和真菌的群落組成，為青藏高原濕地生態(tài)系統(tǒng)安全及管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于青藏高原東北部青海湖流域小泊湖觀測站(36.78° N, 100.80° E)，青海湖湖東，距離湖東種羊場約6 km，是青海湖水位下降遺留下來的沼澤化草甸濕地，平均海拔約3 200 m。該地具有典型的高原大陸性氣候，光照充足，雨量較少，降水主要集中于6月—9月。主要植物類群為華扁穗草 (Blysmussinocompressus) 、禾葉嵩草 (Kobresiagraminifolia)和藏嵩草(Kobresiatibetica) 等[10]。

1.2 試驗設(shè)計及樣品采集

共設(shè)置N2(2 g/m2)、N5(5 g/m2)和N10(10 g/m2)共3個氮添加處理和N0(0 g/m2)1個空白對照處理試驗，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，一共分12個1 m×1 m樣方，樣方間隔1 m作為緩沖帶。施加氮源為NH4NO3，按不同施氮梯度，稱取相應(yīng)的NH4NO3，溶于500 mL水中，用噴壺噴灑于相應(yīng)樣方中，對照噴灑等量的水。從2019年6月至8月，每月中旬取樣后施藥。

于2019年8月中旬植物生長旺盛時采樣，在每塊樣方中按照五點取樣法進行采樣，采用螺旋取土鉆，按照0～15 cm和15～30 cm兩層進行取樣，盡可能去除植物根系及凋落物，放入無菌自封袋中，將約400 g土樣迅速帶回實驗室，并放入冰箱4 ℃冷藏保存，用于測定土壤微生物。

1.3 土壤微生物測定

1.3.1 微生物多樣性提取試劑盒

使用MN NucleoSpin 96 Soil試劑盒/PowerSoil DNA Isolation kit強力土壤DNA提取試劑盒。

1.3.2 擴增引物

細菌16S rRNA (V3+V4)區(qū)域引物：正向引物5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；反向引物5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。真菌ITS1 區(qū)域引物：正向引物5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；反向引物5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.3.3 PCR擴增

目標區(qū)域PCR(10 μL體系)：基因組DNA 50 ng±20%，Vn F(10 μmol/L)0.3 μL，Vn R(10 μmol/L)0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5 μL，dNTP (2 mmol/L each) 2 μL，KOD FX Neo 0.2 μL，ddH2O補至10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，20個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min；4 ℃ ∞。Solexa PCR體系：目的區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物5 μL，MPPI-a(2 μmol/L)2.5 μL，MPPI-b(2 μmol/L)2.5 μL，2×Q5 HF Mmol/L 10 μL。反應(yīng)條件： 98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。1.8%的瓊脂糖凝膠。電壓120 V，40 min。將得到的PCR產(chǎn)物根據(jù)電泳定量結(jié)果，按質(zhì)量比1∶1進行混樣?；鞓雍蟛捎肙MEGA DNA純化柱進行過柱純化。1.8%的瓊脂糖凝膠，120 V、40 min 電泳后切目的片段，并回收?；?Illumina HiSeq測序平臺，對純化的樣品進行測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學(xué)注釋，進而在各水平統(tǒng)計各樣品群落組成。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。Mothur(version v.1.30)軟件分析樣品的α多樣性(Alpha diversity)，R語言繪制樣品 β 多樣性(Beta diversity)分析圖。接著用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One Way ANOVA)和LSD(最小顯著差異法)比較各處理水平之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線

從細菌和真菌在各處理梯度下的稀釋性曲線(圖1)可以看出，在當前樣本量下，曲線趨于平緩，OTU數(shù)目不再隨著樣本量的增加而大量增加，說明當前測序樣本量已足夠，測序結(jié)果合理，當前測序深度可反應(yīng)本次土壤細菌、真菌的真實情況。

2.2 細菌、真菌的Venn圖分析

通過聚類得到各樣品獨有和共有的OTU個數(shù)(圖2)。細菌通過聚類，總共得到1 599個OTU，N0、N2、N5和N10處理分別得到1 528、1 544、1 547和1 548個OTU。其中，有1 508個OTU為4種處理下共有的，均達到各處理梯度下總OTU的95%以上，N0和N5獨有的OUT數(shù)為2，N5和N10沒有獨有的OUT。真菌通過聚類，總共得到1 312個OUT，N0、N2、N5和N10處理分別得到915、879、701和786個OTU。其中，所有處理共有的OTU數(shù)目為345，分別占據(jù)N0、N2、N5和N10處理的37.70%、39.25%、49.22%和43.89%，各處理獨有的OTU數(shù)分別為122、60、37和99。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在門類水平上分別選取細菌和真菌相對豐度為1%的類群，并將其他物種合并為 Others 在圖3中顯示，Unclassified代表未得到分類學(xué)注釋的物種。細菌相對豐度1%的物種有變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、Patescibacteria、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、Latescibacteria、Nitrospinae、螺旋菌門(Spirochaetes)和藍藻菌門(Cyanobacteria)共16種，占據(jù)了整個細菌群落的98%以上，其中變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)相對豐度均在10%以上，總計占據(jù)整個細菌群落的75%以上，為主要優(yōu)勢物種。變形菌門(Proteobacteria)在兩土層中的相對豐度隨施氮濃度的上升均呈現(xiàn)降低趨勢，且N2處理顯著低于N0處理(P<0.05)，N5和N10處理達到極顯著水平(P<0.01)；綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度在0～15 cm土層中隨施氮濃度的增加而降低但變化不顯著(P>0.05)，在15～30 cm土層中也呈現(xiàn)降低趨勢，且在N10處理下顯著低于N0處理(P<0.05)；酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度與變形菌門(Proteobacteria)的趨勢相反，在兩土層中均隨施氮濃度的上升逐漸增加，且都在各處理下均達到顯著水平(P<0.05)；放線菌門(Actinobacteria)在兩土層中的相對豐度在氮處理下均低于N0處理，在0～15 cm土層中沒有達到顯著水平(P>0.05)，在15～30 cm中N10處理顯著低于N0處理(P<0.05)。真菌主要優(yōu)勢菌門有子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢菌門(Mortierellomycota)，相對豐度大于1%的還有球囊菌門(Glomeromycota)和壺菌門(Chytridiomycota)。子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度在0～15 cm土層中隨施氮濃度的增加呈現(xiàn)先降低后增加趨勢，N2處理下達到最低但不顯著(P>0.05)，N10處理下達到最高且顯著高于N0處理(P<0.05)，15～30 cm土層中，其相對豐度隨施氮濃度增加成逐漸上升趨勢，在N10處理下達到顯著水平(P<0.05)；0～15 cm土層中擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對豐度在各處理下均低于N0處理，但差異不顯著(P>0.05)，15～30 cm土層中，其相對豐度隨施氮濃度逐漸增加，N10處理顯著高于N0處理(P<0.05)；0～15 cm土層中被孢菌門(Mortierellomycota)的相對豐度在N5和N10處理下顯著高于N0處理(P<0.05)，在15～30 cm土層中的相對豐度逐漸降低，但變化不顯著(P>0.05)?？芍?，氮沉降背景下，微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變，但是細菌和真菌有所差別，且不同土層中的變化也有一定的差異。

圖3 細菌(a)和真菌(b)優(yōu)勢菌門變化Figure 3 Changes of dominant phylum of bacteria(a)and fungi(b)

圖中橫坐標為不同氮處理。圖4 細菌在0～15 cm土層(a)和15～30 cm土層(b)的α多樣性指數(shù)Figure 4 The diversity index of bacteria at layers soil of 0-15 cm(a)and 15-30 cm(b)

2.4 微生物α多樣性分析

Chao1指數(shù)衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少，Simpson指數(shù)衡量物種優(yōu)勢度，Shannon指數(shù)表示物種多樣性。0～15 cm土層中細菌的豐富度和優(yōu)勢度指數(shù)在施氮條件下均呈現(xiàn)下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；多樣性指數(shù)隨施氮濃度的上升逐漸增加，且N10處理顯著高于N0處理(P<0.05)。15～30 cm土層中細菌的豐富度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)隨施氮濃度均呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢，而多樣性指數(shù)呈現(xiàn)相反的趨勢，差異都沒有達到顯著水平(P>0.05)，具體見圖4。0～15 cm土層中真菌的豐富度指數(shù)在氮處理下減少，其中N5處理達到最低，極顯著低于N0處理(P<0.01)；優(yōu)勢度指數(shù)呈先增加后減少的趨勢，在N2處理達到最高值，N10處理達到最低值，且N10處理顯著低于N0處理(P<0.05)；多樣性指數(shù)增加，且N10處理顯著高于與N0處理(P<0.05)。15～30 cm土層中，真菌的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)隨施氮濃度的增加呈先減少后增加的趨勢，而優(yōu)勢度指數(shù)呈先增加后減少的趨勢，且均在N5處理下達到最低和最高值，但差異均不顯著(P>0.05)，具體見圖5。

2.5 施氮條件下細菌和真菌群落的差異

非度量多維標定法(NMDS)的Stress小于0.2時，表明分析具有一定的可靠性，在坐標圖上距離越近的樣品，相似性越高。基于Bray-curtis距離算法得出細菌和真菌的NMDS分析(圖6)，分析結(jié)果的Stress值均小于0.2，表示NMDS分析結(jié)果合理。非參數(shù)多元方差分析(Permanova)顯示，細菌和真菌群落的P值均小于0.01，細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)在施氮條件下均發(fā)生了顯著改變。

UPGMA聚類樹顯示，土壤細菌群落總體在N0、N2和N10處理下的組成較相近，距離N5水平較遠，土壤真菌群落N0與N2處理下的組成較相近，其次是N5處理，距離N10處理下的土壤真菌群落最遠。隨著施氮濃度的上升，土壤微生物物種組成差距加大。

為進一步鑒別不同處理的顯著差異和主要貢獻生物類別，采用微生物組間差異分析(Lefse)檢驗不同處理間的差異貢獻關(guān)系。結(jié)果(圖7)表明，真菌在N0、N5和N10處理下均有差異顯著的生物標記類群，N0處理下門水平的顯著標志類群是變形菌門(Proteobacteria)，α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)是綱水平上的顯著標志物種，目水平上有紅螺菌目(Rhodospirillales)和Microtrichales，科水平上有紅螺菌科(Rhodopirillaceae)和Ilumatobacteraceae，屬水平上有Defluviicoccus，種水平上是uncultured_bacterium_g_Defluviicoccus。N5處理下門、綱、目、科、屬、種水平下均有顯著貢獻類群，分別是酸桿菌們(Acidobacteria)、Blastocatellia_Subgroup_4、Pyrinomonadales、Pyrinomonadaceae、RB41、uncultured_bacterium_g_RB41。N10處理下門水平上顯著貢獻類群是芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，科水平上是MND1，uncultured_bacterium_g_MND1是種水平上的貢獻類群。真菌在N0和N10處理下有顯著貢獻物種，N0處理下屬水平上是Neoascochyta。N10處理下門水平上的貢獻類群是子囊菌門(Ascomycota)，綱水平上是散囊菌綱(Eurotiomycetes)和子囊菌綱(Sordariomycetes)，目水平上有煤炱目(Capnodiales)和(肉座菌目)Hypocreales，赤殼科(Nectriaceae)和毛殼菌科(Chaetomiaceae)是科水平上的顯著貢獻類群。

圖中橫坐標為不同氮處理。圖5 真菌在0～15 cm土層(a)和15～30 cm土層(b)的α多樣性指數(shù)Figure 5 The diversity index of fungi in layers soil of 0-15 cm(a)and 15-30 cm(b)

圖6 細菌(a)和真菌(b)的NMDS分析Figure 6 NMDS analysis of bacteria and fungi

圖7 土壤真菌(a)和細菌(b)聚類樹柱狀圖組合圖Figure 7 UPGMA combined with histogram chart of fungi(a)and bacteria(b)

圖8 Lefse分析土壤細菌(a)和真菌(b)的差異顯著標志類群Figure 8 Lefse analyzed significant marker groups of differences between soil bacteria(a)and fungi(b)

3 討論與結(jié)論

大氣氮沉降是目前全球變化中的熱點問題之一，可直接或間接影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。土壤微生物是土壤中重要組分之一，是影響土壤健康評價的關(guān)鍵因子[11]。研究表明：土壤細菌的優(yōu)勢菌門有變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和芽胞菌門[12]；真菌優(yōu)勢菌門有子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢菌門和壺菌門[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門和被孢菌門為優(yōu)勢菌門，與上述研究基本一致。但氮添加改變了微生物群落各門類的相對豐度，如變形菌門和放線菌門在各氮處理下相對豐度均低于N0對照處理，變形菌門在N2處理顯著低于N0處理，N5和N10更是達到了極顯著水平；放線菌門的相對豐度在N10處理下也顯著低于N0處理；酸桿菌門的相對豐度在施氮處理下顯著高于N0處理。研究認為，酸桿菌門與土壤氮含量有正相關(guān)關(guān)系[15]，施氮使土壤氮含量增加，從而使酸桿菌門的相對豐度增加。Fierer等[16]認為，當土壤中氮素增加時，一些富營養(yǎng)型的菌群豐度會增加，如變形菌門等。本研究變形菌門的相對豐度隨氮處理呈下降趨勢，這可能與高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性和敏感性有關(guān)，但具體機理還有待進一步研究。本研究中子囊菌門的相對豐度為43.34%～68.15%，子囊菌門占據(jù)土壤菌群的主要地位，且在氮處理下均高于N0處理。這可能與其強大的環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。擔(dān)子菌門相對豐度與土壤氮呈負相關(guān)關(guān)系[17]，擔(dān)子菌門的相對豐度在0 ～15 cm土層中減少，在15～30 cm土層中增加，可能是施氮主要影響上層土壤氮含量，使上層土壤擔(dān)子菌相對豐度下降，下層變化相反可能是因為土壤的富營養(yǎng)狀態(tài)，使富營養(yǎng)型菌群增加，降低菌群競爭從而使擔(dān)子菌門相對豐度有所上升。

氮沉降會改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性[18-19]。研究表明氮添加改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[20]。由細菌和真菌的Venn圖(圖2)可知，各處理下細菌OTU數(shù)均達到了總OTU數(shù)的95%以上，各處理下真菌的OTU數(shù)占據(jù)總OTU數(shù)的37.70%～49.22% ，表明細菌群落相較于真菌群落總體對氮沉降有較強的穩(wěn)定性，真菌群落結(jié)構(gòu)變化大于細菌。NMDS分析(圖6)表明，在不同的氮處理水平下，土壤微生物群落發(fā)生了顯著改變。UPGMA聚類樹(圖7)也顯示，氮處理下，土壤細菌和真菌的群落組成產(chǎn)生了顯著變化。微生物優(yōu)勢菌門的結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，在N2處理中，放線菌門和酸桿菌門的相對豐度與對照處理產(chǎn)生顯著差異，而子囊菌門的相對豐度在高濃度氮N10處理中與對照產(chǎn)生顯著差異，表明細菌較真菌對氮沉降更為敏感。真菌擁有極強的纖維素降解能力[25]，在較小范圍的環(huán)境變化下有更好的調(diào)節(jié)能力及穩(wěn)定性。土壤細菌的豐富度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)在兩土層中的變化均不顯著，主要表現(xiàn)為下降，多樣性指數(shù)在0～15 cm土層中有顯著增加(圖4)。分析認為，可能是氮添加使微生物活性受抑制，減少了優(yōu)勢物種的出現(xiàn)，降低了土壤細菌的競爭，從而使細菌多樣性上升[22]。氮處理使土壤真菌的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著下降而優(yōu)勢度指數(shù)增加(圖5)，真菌受環(huán)境影響較大，真菌群落對不斷增加的氮處理有彈性響應(yīng)[23]。真菌群落在不同氮處理水平下的結(jié)構(gòu)差異可能與試驗地環(huán)境、海拔高度、施氮時間等多種因素相關(guān)[24]。

氮沉降背景下，土壤細菌和真菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，但響應(yīng)程度不相同，細菌較真菌對氮沉降的感應(yīng)敏感。本研究在短期氮沉降背景下探討了土壤微生物群落的分布差異，可為短期氮沉降背景下的環(huán)境響應(yīng)提供參考，卻無法深入評估長期氮沉降變化下濕地土壤環(huán)境的變化過程。今后應(yīng)注重長期持續(xù)的觀測實驗，來揭示生態(tài)系統(tǒng)對氮沉降的具體響應(yīng)機制。