田國永 鹿國英 呂志軍 付深利

中圖分類號:R739.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.023

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種具有侵襲性的上皮性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與多個(gè)基因表達(dá)異常有關(guān)，尋找有效的預(yù)后標(biāo)志物對改善患者預(yù)后具有重要意義。程序性死亡分子1(programmed cell death 1，PD-1)是免疫抑制分子，可誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，程序性死亡受體-配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是PD-1配體之一，主要在惡性腫瘤組織中誘導(dǎo)表達(dá)，PD-1/PD-L1途徑可限制過度免疫反應(yīng)，保護(hù)正常組織免受損傷[1]。發(fā)生腫瘤時(shí)，誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)升高，激活PD-1/PD-L1途徑，促使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)殺傷，在體內(nèi)存活增殖。已有研究顯示，PD-L1在胰腺導(dǎo)管腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常高表達(dá)，通過靶向阻斷PD-1/PD-L1通路，是促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要途徑之一[2-3]。目前，PD-L1、PD-L1在OSCC中研究較少，本研究分析PD-L1、PD-L1在OSCC組織中表達(dá)，旨在探討其對OSCC預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015 年06 月～2018 年03 月期間，本院收治的OSCC患者93 例，其中男性52 例，女性41 例，年齡35～72 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診為OSCC，術(shù)前未進(jìn)行任何治療；(2)經(jīng)頜面外科醫(yī)生評估，可予以手術(shù)切除；(3)術(shù)后病理學(xué)確診為OSCC；(4)接受手術(shù)及輔助放化療的綜合治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫性疾?。?2)合并有口腔黏膜疾?。?3)合并有其他部位腫瘤；(4)住院期間死亡患者。本研究獲得所有患者及家屬同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

用10%中性甲醛固定腫瘤及癌旁組織，包埋、切片，脫蠟水化，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。取切片，脫蠟水化，枸櫞酸鈉修復(fù)抗原，3%H2O2避光孵育10 min，PBS浸洗，加入山羊血清封閉液，加入PD-1單抗、PD-L1單抗4℃孵育過夜，復(fù)溫，PBS浸洗，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果判定[4]：采用雙盲法閱片，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分，≤2 分為陰性(-)，>2 分為陽性(+)。

根據(jù)染色結(jié)果分析：(1)PD-1、PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(dá)；(2)PD-1、PD-L1在OSCC組織中表達(dá)相關(guān)性；PD-1、PD-L1表達(dá)與臨床病例參數(shù)相關(guān)性；(3)PD-1、PD-L1對OSCC預(yù)后預(yù)測價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以(例，%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；生存率組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)，Spearman采用相關(guān)分析法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，癌旁組織黏膜上皮層次結(jié)構(gòu)正常；OSCC組織細(xì)胞異型，呈核分裂像，鱗狀上皮增生，癌細(xì)胞呈條索狀或團(tuán)塊狀侵入結(jié)締組織內(nèi)(圖1)。

圖1 組織病理學(xué)檢查(HE， ×200)

2.2 PD-1、PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(dá)

PD-1、PD-L1在OSCC組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織(P<0.05)(表1，圖2～3)。

表1 癌旁組織和OSCC組織PD-1、PD-L1表達(dá)[n(%)]Tab 1 PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

圖2 PD-1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(dá)(SP, ×400)

圖3 PD-L1在癌旁組織和OSCC組織中的表達(dá)(SP×400)

2.3 PD-1和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

PD-1和PD-L1在OSCC及癌旁組織中表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)(表2)。

表2 PD-1、PD-L1表達(dá)在OSCC及癌旁組織表達(dá)相關(guān)性分析[n(%)]Tab 2 Correlation analysis of PD-1 and PD-L1 expression in OSCC and adjacent tissues[n(%)]

2.4 PD-1、PD-L1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

低分化程度OSCC組織中PD-1陽性表達(dá)率高于高分化組織(P<0.05)；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和III～I(xiàn)V期OSCC組織中PD-L1陽性表達(dá)率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期組織(P<0.05)(表3)。

2.5 PD-1、PD-L1表達(dá)對OSCC預(yù)后的影響

共82 例患者獲得隨訪。PD-1、PD-L1陰性表達(dá)患者生存率均高于陽性表達(dá)患者(P<0.05)(圖4)。

圖4 PD-1和PD-L1陽性表達(dá)與陰性表達(dá)OSCC患者總生存率比較

3 討 論

OSCC轉(zhuǎn)移和發(fā)展涉及多基因共同作用，其中免疫學(xué)腫瘤微環(huán)境與OSCC發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[5]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答，腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的關(guān)鍵。PD-1及其配體PD-L1是重要免疫檢查點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞中PD-1與PD-L1結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，與預(yù)后不良有關(guān)[6]。腫瘤微環(huán)境中免疫機(jī)制與OSCC關(guān)系密切，本研究通過檢測PD-1、PD-L1在OSCC中的表達(dá)及意義，以期為OSCC免疫治療提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

腫瘤組織中PD-1、PD-L1高表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞活化有關(guān)，阻斷PD-1/PD-L1的免疫療法有望成為新的替代治療方法[7]。既往研究顯示，PD-1、PD-L1在小兒腦腫瘤以及非小細(xì)胞肺癌患者中陽性表達(dá)率均較高[8-9]。本研究采用免疫組化法對OSCC患者癌旁組織和腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，OSCC組織中PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，提示PD-1、PD-L1與OSCC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，高表達(dá)PD-1、PD-L1可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，為OSCC進(jìn)行免疫治療提供病理支持。另外，PD-1、PD-L1高表達(dá)還與腫瘤一些臨床特征密切相關(guān)，Cao等[10]研究顯示，結(jié)膜黑色素瘤患者可檢測到PD-1、PD-L1表達(dá)，且PD-L1表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者生存期有關(guān)。Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者PD-1、PD-L1表達(dá)升高，PD-L1高表達(dá)與rTNM分期、貧血狀態(tài)以及復(fù)發(fā)有關(guān)。郭曉宇等[12]報(bào)道，胃癌患者PD-1表達(dá)與浸潤深度有關(guān)，而PD-L1表達(dá)與患者年齡、腫瘤分化程度、直徑以及浸潤深度有關(guān)。本研究進(jìn)一步對PD-1、PD-L1表達(dá)與患者年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期的關(guān)系進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，低-中分化OSCC組織中PD-1陽性表達(dá)率高于高分化，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和III～I(xiàn)V期OSCC組織中PD-L1陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期，由此可知，PD-1、PD-L1不僅參與OSCC進(jìn)展，并且兩者陽性表達(dá)率隨著OSCC惡性程度升高而增加，提示PD-1、PD-L1表達(dá)水平與OSCC患者病情程度有關(guān)。

PD-1、PD-L1作為腫瘤免疫逃逸中關(guān)鍵分子，在腫瘤中具有預(yù)后價(jià)值。Tan等[13]檢測164例卵巢癌患者外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平，表明PD-1、PD-L1多態(tài)性可增加卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)，二者表達(dá)異常與預(yù)后不良關(guān)系密切。Wyss等[14]發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性結(jié)腸癌和肝轉(zhuǎn)移瘤患者間質(zhì)PD-1、PD-L1表達(dá)與患者腫瘤侵襲性生物學(xué)行為有關(guān)，可作為預(yù)后指標(biāo)。在轉(zhuǎn)移性透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌患者中，PD-1、PD-L1表達(dá)與腫瘤惡性程度及T淋巴細(xì)胞浸潤相關(guān)，并可影響患者整體生存率[15]。本研究應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線比較PD-1和PD-L1不同表達(dá)患者生存率，結(jié)果顯示，PD-1和PD-L1高表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間較低表達(dá)患者明顯減少，提示PD-1、PD-L1與OSCC患者生存率有關(guān)，具有重要預(yù)后意義，PD-1、PD-L1表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

本研究初步顯示，PD-1、PD-L1在OSCC患者中陽性表達(dá)率較高，與預(yù)后不良有關(guān)，可作為預(yù)后潛在生物標(biāo)記物。但本研究選取樣本量較少，PD-1、PD-L1在OSCC中具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步大樣本研究，為OSCC治療提供實(shí)驗(yàn)支持，提高患者預(yù)后。