劉洪偉 魏麗 林凡忠 吳德報(bào)

中圖分類號(hào):R739.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.022

唾液腺多形性腺瘤(salivary gland pleomorphic adenoma,SPA)是較為常見的一種唾液腺腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，生長緩慢且后期部分容易惡變。惡變的SPA又稱為癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adeoma,CPA)[1]。SPA和CPA手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)，目前多認(rèn)為是腫瘤大小、組織類型、衛(wèi)星灶、手術(shù)方式、邊緣的侵襲性及手術(shù)中的腫瘤破潰等因素相關(guān)[2-3]。因此探究多形性腺瘤的發(fā)病機(jī)理、術(shù)后復(fù)發(fā)、惡變的機(jī)制，是目前治療該疾病的重要一環(huán)。有關(guān)研究表明復(fù)發(fā)性多形性腺瘤多與腫瘤細(xì)胞的增殖活性相關(guān)，增殖活性的失控的原因目前成為焦點(diǎn)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-realted factor 2,Nrf2)在上皮性腫瘤細(xì)胞中的激活與抗氧化酶的誘導(dǎo)有關(guān)，能夠早期影響氧化應(yīng)激損傷或者氧自由基的傳遞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡變[4]。從氧化應(yīng)激方面研究唾液腺多形性腺瘤較少，本研究通過免疫組化方法檢查探索Nrf2在SPA和正常腮腺組織中的表達(dá)，探討它在SPA相關(guān)生物學(xué)行為的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入2018 年04 月～2020 年10 月在山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院口腔頜面外科就診的SPA及癌在多形性腺瘤中手術(shù)切除病理標(biāo)本50 例，瘤旁組織標(biāo)本50 例，其中原發(fā)性SPA 39 例，復(fù)發(fā)性SPA 5 例，CPA 6 例。包括男性37 例，女性13 例，年齡21～77 歲，平均年齡55.32 歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者的臨床病理資料完整；(2)患者及家屬知情并簽署同意書；(3)病理均診斷為SPA及CPA。腫瘤累及腮腺38 例，頰部2 例，上腭4 例，頜下6 例，腫瘤大小約2.0～4.0 cm，惡性腫瘤均無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑及儀器

Nrf2抗體(Abcam公司，美國)；二抗檢測系統(tǒng)(MaxVision)的HRP抗兔/鼠IgG產(chǎn)品、PBS緩沖液、蘇木素染液、DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；脫水機(jī)(ASP300S)、切片機(jī)(RM2235)(Leica公司，德國)；包埋機(jī)(EC350，MICROM公司，德國)；顯微鏡(BX51，奧林巴斯公司,日本)；顯微拍照系統(tǒng)(EOS600D，Canon公司，日本)。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法染色

組織標(biāo)本經(jīng)過脫蠟水洗后，EDTA(pH 8.0)進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，水洗，3%的H2O2室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS沖洗3 次，3 min/次滴加一抗Nrf2(稀釋：1∶150)室溫孵育1 h，PBS沖洗3 次，3 min/次，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 次，3 min/次，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

組織切片由病理科資深醫(yī)師進(jìn)行雙盲法判讀，分析鏡下細(xì)胞染色及陽性細(xì)胞百分率。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野。根據(jù)細(xì)胞染色程度分為基本不染色為0 分，淡黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分，褐色4 分；陽性細(xì)胞百分率：≤10%為0 分，11%～30%為1 分，31%～60%為2 分，61%～80%為3 分，>81%為4 分。染色程度和陽性百分率之和綜合評(píng)分，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)，其中(-)和(+)為低表達(dá)組，(++)和(+++)為高表達(dá)組[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPASS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較均采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Nrf2蛋白在唾液腺SPA及CPA中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nrf2在SPA、CPA及腺旁正常組織中均有表達(dá)(圖1)，Nrf2陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，鏡下為棕黃色顆粒。Nrf2在涎腺腫瘤周圍正常組織陰性37 例(74.00%，37/50)，弱陽性13 例(26.00%，13/50)。Nrf2在腫瘤表達(dá)弱陽性22 例(44.00%，22/50)，強(qiáng)陽性28(56.00%，28/50)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)Nrf2蛋白表達(dá)與腫瘤發(fā)生有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 Nrf2在SPA及CPA中的表達(dá)結(jié)果Tab 1 The expression of Nrf2 in SPA and CPA

圖1 Nrf2在SPA和CPA中的表達(dá)(×200)

2.2 Nrf2蛋白表達(dá)與腫瘤病理特征的相關(guān)性

多形性腺瘤不同的病理特征表現(xiàn)為腫瘤包膜的完整性、腫瘤未侵犯包膜、腫瘤包膜不完整、腫瘤侵及包膜及衛(wèi)星灶、癌在腫瘤中等。Nrf2在腫瘤細(xì)胞中不同的病理類型的表達(dá)：腫瘤不侵犯包膜且包膜完整(+)10 例，(++)3 例；腫瘤包膜不完整(++)6 例，(+)9 例；腫瘤侵及包膜及有衛(wèi)星灶(++)13 例，(+)3 例，癌在多形性腺瘤(++)6 例。Nrf2在不同的腫瘤病理特征中，陽性表達(dá)率有所不同，顯示腫瘤侵犯包膜、衛(wèi)星灶及惡變呈正相關(guān)(表2)。

表2 SPA及CPA中Nrf2表達(dá)與病理特征的相關(guān)性Tab 2 Correlation between the expression of Nrf2 and the pathological features of SPA and CPA

2.3 Nrf2蛋白表達(dá)與原發(fā)性和復(fù)發(fā)性多形性腺瘤的相關(guān)性

原發(fā)性唾液腺多形性腺瘤中陽性表達(dá)率46.15%(18/39),復(fù)發(fā)性多形性腺瘤陽性表達(dá)率80%(4/5), 癌在多形性腺瘤陽性表達(dá)率100%(6/6)(表3)。

表3 Nrf2在原發(fā)性、復(fù)發(fā)性SPA及CPA的表達(dá)結(jié)果Tab 3 The expression of Nrf2 in primary, recurrent SPA and CPA

3 討 論

多形性腺瘤是唾液腺腫瘤中最常見的疾病之一，其特點(diǎn)生長緩慢，易復(fù)發(fā)，加速生長易惡變，部分具有侵襲性。因此研究者們進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)和研究，積極尋找多形性腺瘤發(fā)病機(jī)制及良惡性腫瘤轉(zhuǎn)化原因，為制定腫瘤治療提供依據(jù)。近些年來，有大量文獻(xiàn)報(bào)告Nrf2基因與腫瘤之間的關(guān)系，表明其與肺癌、甲狀腺癌、肝癌、乳腺癌等的相關(guān)性[6-8], Nrf2是協(xié)同刺激分子B7家族成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)腫瘤和抑制腫瘤作用兩面性，通過Nrf2-Keap1/ARE系統(tǒng)通路參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，抵御外來因素誘發(fā)的氧化損害。Nrf2不僅具有維持機(jī)體氧化還原平衡抑制腫瘤的發(fā)生，還具有過度表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖能力，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Nrf2持續(xù)激活抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與惡化。吳智華等[9]舌鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2高表達(dá)說明其在發(fā)生發(fā)展及預(yù)后過程中起到重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，有關(guān)研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，活性氧是氧化應(yīng)激的重要產(chǎn)物，NF-kB是氧化還原調(diào)節(jié)的氧化感受器，在多數(shù)腫瘤患者中檢測到活性氧的升高，激活NF-kB途徑同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)胞的增殖的調(diào)節(jié)失控，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞無限增殖、自主分裂和腫瘤的形成。Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中重要的效應(yīng)分子，能夠?qū)ν庠葱該p傷因素進(jìn)行Nrf2-Keap1系統(tǒng)活化[13-14]，抵制外來因素誘發(fā)的氧化損害、維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用。

多形性腺瘤是涎腺中最常見的涎腺上皮腫瘤，具有病程長、多次復(fù)發(fā)、易惡變等特點(diǎn)，近些年研究者多從細(xì)胞遺傳學(xué)、抑癌基因、基質(zhì)蛋白等方面進(jìn)行研究[15-17]，大多數(shù)學(xué)者[18-19]認(rèn)為多形性腺瘤的復(fù)發(fā)和惡變同腫瘤所含上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，上皮細(xì)胞豐富則腫瘤容易惡變，而基質(zhì)細(xì)胞豐富更易于復(fù)發(fā)。劉芳等[20]的研究發(fā)現(xiàn)NF-kB可能與多形性腺瘤的復(fù)發(fā)和惡變有關(guān)。近期有關(guān)研究[21]發(fā)現(xiàn)Nrf2在大鼠腮腺條紋狀小葉間管細(xì)胞和周圍腺胞細(xì)胞表達(dá)，而在多形性腺癌中表現(xiàn)出現(xiàn)高表達(dá)，并且同轉(zhuǎn)移與Nrf2的過表達(dá)有顯著的相關(guān)性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在腺體組織及腫瘤腺多在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，正常腺體組織內(nèi)表達(dá)弱陽性表達(dá)占到26%，無強(qiáng)陽性表達(dá)。多形性腺瘤及癌在多形性腺瘤中Nrf2均出現(xiàn)表達(dá)，強(qiáng)弱不等，表達(dá)的強(qiáng)弱均同腫瘤的病理學(xué)特征及腫瘤細(xì)胞的類型相關(guān)。腫瘤包膜不完整、出現(xiàn)衛(wèi)星灶、侵犯包膜及腫瘤惡變等均出現(xiàn)強(qiáng)陽性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞豐富型多形性腺瘤陽性率較基質(zhì)豐富性多形性腺瘤高。本實(shí)驗(yàn)研究表明癌在多形性腺瘤Nrf2陽性表達(dá)率均高于復(fù)發(fā)性和原發(fā)性多形性腺瘤，因此可以推測Nrf2陽性表達(dá)率高的的多形性腺瘤更容易發(fā)生惡變、復(fù)發(fā)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，良惡性多形性腺瘤的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激可能密切相關(guān)，Nrf2表達(dá)水平是非常重要的預(yù)測因子，Nrf2-Keap1系統(tǒng)通路可能參與了腫瘤的演變，Keap1的作用還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究，并通過基因檢測明確具體機(jī)制。