王偉峰 李娜

中圖分類號(hào):R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.007

人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，hGMSCs)具有可塑性強(qiáng)、無(wú)免疫排斥、易于獲取、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是研究細(xì)胞骨向分化、骨組織改建等生理過(guò)程的理想材料，被越來(lái)越多的應(yīng)用于修復(fù)牙組織缺損的研究，如何促進(jìn)其成骨分化成為研究的熱點(diǎn)[1-3]。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是從大麻提取的化合物，無(wú)神經(jīng)致幻作用，且藥用價(jià)值越加明顯，可通過(guò)腺苷A1途徑抑制凋亡、抗氧化自由基等方式治療多發(fā)性硬化、舞蹈病、炎癥等[4-5]，但CBD對(duì)hGMSCs成骨分化的影響，相關(guān)報(bào)道較少。本研究擬通過(guò)研究CBD對(duì)hGMSCs成骨分化的影響，為牙組織工程修復(fù)提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿性磷酸酶(alkaline Phosphatase, ALP)試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；CBD(上海源葉生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI公司，德國(guó))；Trizol試劑盒(Gibco-BRL公司，美國(guó))；紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國(guó))；熒光定量PCR分析儀(BIO-RAD公司，美國(guó))；CCK-8試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測(cè)定檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；茜素紅、Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT(Sigma公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hGMSCs的分離提取和培養(yǎng) 收集進(jìn)行牙拔除術(shù)的健康牙齦組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。將牙齦組織剪碎至1 mm3左右，接種于含適量間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(15%FBS、1%青-鏈霉素、100 mmol/L維生素C)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2的條件下的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d進(jìn)行1 次換液，當(dāng)細(xì)胞融合到80%～90%的程度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 hGMSCs的鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第三代hGMSCs進(jìn)行TrypLE消化，離心后制成細(xì)胞懸液(5×105/mL)，加入1 μL hGMSCs表面標(biāo)記物CD73、CD90及CD105抗體。室溫避光孵育15 min，加入1×FACSTM裂解液，室溫避光靜置15 min，溶血后離心5 min，棄上清，用含有0.1%NaN3和1%BSA的PBS洗液離心洗滌5 min，棄上清，上Attune NxT流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技公司，美國(guó))，Cell Quest Pro軟件獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo Version 8.7.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)CBD對(duì)hGMSCs增殖活性的影響 將hGMSCs接種于96孔板(2×103/孔)，1 d后PBS洗滌，更換培養(yǎng)液。將96 孔板細(xì)胞隨機(jī)分為8組，分別加入不同濃度的CBD(0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)，空白組hGMSCs僅加入完全培養(yǎng)基，每組樣本另設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)3 d時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8工作液，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值。繪制細(xì)胞增殖曲線。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇對(duì)hGMSCs增殖無(wú)影響的CBD濃度。

1.2.4 成骨誘導(dǎo)和茜素紅染色 將hGMSCs接種于24孔板(1×105個(gè)/孔)，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(15%FBS、100 mmol/L維生素C、10 nmol/L地塞米松、1.8 mmol/L磷酸二氫鉀)分別加入含0、2、4、8 μmol/L CBD的細(xì)胞。每3 d換1 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 周后，每孔細(xì)胞加入適量4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，加入0.1%茜素紅進(jìn)行染色，10 min后進(jìn)行蒸餾水沖洗，在室溫下風(fēng)干。觀察各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色情況。

1.2.5 ALP活性檢測(cè) 將hGMSCs接種于24 孔板(1×108個(gè)/孔)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(15%FBS、100 mmol/L維生素C、10 nmol/L地塞米松、1.8 mmol/L磷酸二氫鉀)分別加入含有0、2、4、8 μmol/L CBD的細(xì)胞，每3 d換1 次培養(yǎng)基。在第2周時(shí)，使用ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性，同時(shí)選擇405 nm波長(zhǎng)，使用酶聯(lián)儀(艾迪公司，德國(guó))檢測(cè)hGMSCs的吸光度值，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3 次。

1.2.6 成骨相關(guān)基因檢測(cè) 將含有0、2、4、8 μmol/L CBD的細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，再將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，β-actin為內(nèi)參，用PCR儀和SYBR GREEN試劑盒對(duì)各成骨相關(guān)基因(Col-1、OCN、Runx2)進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，dH2O 6.0 μL，反應(yīng)條件：在95 ℃條件下進(jìn)行3 min預(yù)變性，在62 ℃條件下退火15 s，73 ℃延伸45 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔct法計(jì)算各成骨相關(guān)基因(Col-1、OCN、Runx2)mRNA的相對(duì)濃度。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各目的基因引物序列Tab 1 The primer sequences of the target genes

1.2.7 Western blot檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白 將hGMSCs接種于六孔板(1×105個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞融合至90%時(shí)，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(15%FBS、100 mmol/L 維生素C、10 nmol/L地塞米松、1.8 mmol/L 磷酸二氫鉀)分別加入含有0、2、4、8 μmol/L CBD的細(xì)胞。培養(yǎng)10 d時(shí)加入細(xì)胞裂解液，收集蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，凝膠電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉封閉液中孵育2 h。加入一抗Notch1(稀釋比例1∶1 000)、Hes-1(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3 次，加入二抗(稀釋比例1∶3 000)，室溫孵育1 h。洗膜后曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8 Notch信號(hào)通路抑制劑處理細(xì)胞 將hGMSCs接種于六孔板(1×105個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞融合至90%時(shí)，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(15%FBS、100 mmol/L 維生素C、10 nmol/L地塞米松、1.8 mmol/L 磷酸二氫鉀)分別加入含有2 μmol/L CBD和2 μmol/L CBD+10 μmol/L Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT，對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色、成骨相關(guān)基因檢測(cè)和Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白WB檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 hGMSCs原代培養(yǎng)分離結(jié)果

hGMSCs經(jīng)原代培養(yǎng)1 周后，組織周邊可見(jiàn)梭形細(xì)胞；10～12 d后hGMSC融合度可達(dá)80%以上；第三代的hGMSC貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，大小形態(tài)均勻。

2.2 hGMSC表面標(biāo)記物鑒定結(jié)果

第三代hGMSC強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD73(98.9%)、CD90(96.2%)及CD105(97.4%)(圖1)。

圖1 流式檢測(cè)hGMSC細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物

2.3 CBD對(duì)hGMSC細(xì)胞增殖的影響

培養(yǎng)至3 d時(shí)，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CBD在16～128 μmol/L范圍內(nèi)均能促進(jìn)hGMSC增殖(P<0.05)，當(dāng)CBD濃度為32 mol/L時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)。選擇不影響細(xì)胞增殖的2、4、8 μmol/L CBD進(jìn)行后續(xù)hGMSC骨向分化實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 CBD對(duì)hGMSCs增殖活性的影響

2.4 各組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果比較

0、2、4、8 μmol/L CBD對(duì)hGMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。各組細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的礦化面積分別為8.67%±1.09%、15.65%±4.53%、25.67%±6.53%和43.00%±8.76%(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組hGMSCs細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果比較

2.5 各組細(xì)胞ALP活性比較

0、2、4、8 μmol/L CBD各組hGMSCs ALP活性分別為0.41±0.08、0.56±0.11、0.74±0.18和0.92±0.33(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同濃度CBD下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP活性比較 圖5 CBD對(duì)Col-1、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響

2.6 各組hGMSCs骨向分化基因檢測(cè)

隨著CBD濃度的升高，各組hGMSCs Col-1、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)(圖5)。

2.7 Notch通路相關(guān)蛋白檢測(cè)

Western blot 檢測(cè)顯示，隨著CBD濃度的升高，各組hGMSCs細(xì)胞中Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)(圖6)。

圖6 CBD對(duì)Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)水平的影響

2.8 Notch通路抑制劑對(duì)hGMSCs成骨分化的影響

hGMSCs細(xì)胞分2 μmol/L CBD組和2 μmol/L CBD+DAPT組，茜素紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L CBD+DAPT組礦化面積低于2 μmol/L CBD組(圖7A，P<0.05)；Col-1、OCN、Runx2 mRNA表達(dá)水平低于2 μmol/L CBD組(圖7B，P<0.05)，Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)水平低于2 μmol/L CBD組(圖7C，P<0.05)。

圖7 Notch通路抑制劑對(duì)hGMSCs細(xì)胞成骨分化的影響

3 討 論

hGMSCs因取材方便，體外培養(yǎng)簡(jiǎn)單以及多向分化(骨、肌肉、脂肪等)的潛能等優(yōu)點(diǎn)，成為骨組織工程重要的細(xì)胞來(lái)源[6-7]。已有相關(guān)研究[8]將GMSCs應(yīng)用于牙周炎的治療中，研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)移植的GMSCs可以歸巢到牙周損傷部位，并促進(jìn)牙周組織再生。CBD是從大麻化合物中分離的重要化學(xué)物質(zhì)[9-10]。相關(guān)研究[11-12]顯示，CBD作用于大麻素受體1(Cannabinoid 1 receptor)和大麻素受體2(Cannabinoid 2 receptor)，具有抗嘔吐、神經(jīng)保護(hù)、保肝、抗炎、抗氧化和抗痙攣等多種作用，但CBD對(duì)hGMSCs成骨分化的影響，相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過(guò)研究CBD對(duì)hGMSCs成骨分化及增殖的影響，旨在探討CBD對(duì)hGMSCs在組織工程修復(fù)過(guò)程中的作用。

Schmuhl等[13]的研究顯示，CBD通過(guò)激活p42/44 MAPK途徑誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化能力，并且加強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的礦化能力和堿性磷酸酶的活性，且此作用可被AM-630(CB受體拮抗劑)所抑制。那么對(duì)于同樣具有多向分化潛能的hGMSCs，CBD是否依然具有誘導(dǎo)其骨向分化和增殖活性的作用?本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(16 μmol/L)CBD可以促進(jìn)hGMSCs增殖。為了探討CBD對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用是否不依賴于增殖，因此選擇對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均可形成礦化結(jié)節(jié)，未經(jīng)CBD作用的hGMSCs礦化面積小，礦化結(jié)節(jié)顏色較淺，而予以不同濃度CBD作用下實(shí)驗(yàn)組hGMSCs的礦化面積均顯著大于未經(jīng)CBD作用的hGMSCs，顏色更深，且隨著加入CBD濃度的增高，hGMSCs的礦化面積越來(lái)越大，礦化結(jié)節(jié)顏色越來(lái)越深。因此，CBD有促進(jìn)hGMSCs成骨分化的能力，且隨著濃度的升高，CBD對(duì)hGMSCs成骨分化的促進(jìn)能力越強(qiáng)。

ALP是一種金屬水解酶是具有成骨細(xì)胞活性的重要標(biāo)記物，存在于細(xì)胞核中的ALP與細(xì)胞的增殖能力顯著相關(guān)[14]。ALP活性提升，可促進(jìn)骨鈣素的合成，并抑制糖類降解，誘導(dǎo)糖異生，可促進(jìn)具有成骨活性的細(xì)胞的增殖和分化，并通過(guò)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1)抑制破骨因子的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，予以不同CBD濃度作用下hGMSCs ALP活性均顯著大于未經(jīng)CBD作用hGMSCs的ALP活性，且隨著加入CBD濃度的增高，hGMSCs的ALP活性逐漸增高。

Col-1是具有高度有序的自我組裝序列的膠原纖維，在骨組織中含量較高[15]。OCN是一種由49個(gè)氨基酸組成的維生素K依賴性鈣結(jié)合蛋白，它主要由成骨細(xì)胞合成，在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起重要作用，是研究骨代謝的一項(xiàng)新的生化標(biāo)志物[16]。Runx2是一種成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，是骨組織中骨含量的標(biāo)志物[17]。予以高濃度CBD作用下，hGMSCs 骨向分化基因(Col-1、OCN、Runx2)mRNA表達(dá)水平均顯著大于未經(jīng)CBD作用的hGMSCs。因此，CBD可促進(jìn)hGMSCs骨向分化基因(Col-1、OCN、Runx2)mRNA的上調(diào)。

Notch信號(hào)通路是一種較為保守的信號(hào)通路，通過(guò)纖維素合酶(CesA like，CSL)依賴途徑參與到細(xì)胞增殖與分化、腫瘤血管生成、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生理病理過(guò)程[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CBD可提高Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Notch1、Hes-1)的表達(dá)水平，且較高CBD的濃度有助于Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Notch1、Hes-1)表達(dá)水平的提高。Notch信號(hào)通路近年來(lái)被證實(shí)廣泛參與體內(nèi)骨骼系統(tǒng)的成骨過(guò)程，是干細(xì)胞成骨分化調(diào)控的重要機(jī)制。通過(guò)對(duì)hGMSCs進(jìn)行Notch通路抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未添加Notch通路抑制劑的hGMSCs相比，Notch通路抑制劑可以降低hGMSCs成骨相關(guān)基因(Col-1、OCN、Runx2 )mRNA表達(dá)水平，抑制成骨分化。因此，CBD對(duì)于hGMSCs骨向分化作用有可能是通過(guò)激活Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，大麻二酚可誘導(dǎo)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化并促進(jìn)其增殖，且隨著大麻二酚濃度的升高，其誘導(dǎo)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用越強(qiáng)，這種促進(jìn)作用有可能是通過(guò)激活Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。