董朝軍，劉宣毅，李 冕，東 彬，楊曉雅

（河北省滄州市人民醫(yī)院，滄州 061000）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨變性和丟失及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，隨著我國老齡化社會進展和肥胖人口增多，KOA 發(fā)病率呈逐年上升的趨勢且已成為主要的下肢致殘原因，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。因此，KOA 的治療應(yīng)該引起足夠的重視，臨床上多通過緩解或消除疼痛、矯正關(guān)節(jié)畸形、改善關(guān)節(jié)功能，來提高患者的生活質(zhì)量。王華敏等[2]研究表明，Janus 激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信號通路在介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、干細胞生長因子-β（SCGF-β）是促進新生血管形成、細胞異常增殖及分化的重要因子，并有可能導(dǎo)致滑膜炎癥反應(yīng)持續(xù)存在[4]。本研究旨在探討JAK2/STAT3 信號通路調(diào)控SCGF-β 及VEGF 表達對KOA發(fā)病的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD 雌性大鼠40 只，體重（200±20）g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXY（甘）2009-0004，使用許可證號：SYXK（甘）2009-0005。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23 ℃，相對濕度50%～60%。所有大鼠實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水和攝食。動物的使用符合科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑 木瓜蛋白（917B023）和L-半胱氨酸（314B024）購自北京索萊寶科技有限公司。JAK2 特異性抑制劑AG490、JAK2 激活劑DUSP19購自美國Sigma 公司。蘇木精—伊紅（HE）染液購自甘肅隆鑫商貿(mào)有限公司。一抗磷酸化JAK2（PJAK2）、磷酸化STAT3（P-STAT3）、SCGF-β和VEGF均購自美國CST公司；二抗購自丹麥Dako公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3 L-半胱氨酸—木瓜蛋白酶混合液及混合脫鈣液的配置（1）精密稱取0.50 g木瓜蛋白酶，置于離心管中，加入10 mL 生理鹽水及0.03 mol/L 的L-半胱氨酸，混勻，0.22 μm濾膜過濾，制得5%（w/v）木瓜蛋白酶和0.03 mol/L 的L-半胱氨酸混合液，冷藏備用。（2）混合脫鈣液的配置：濃鹽酸21.25 mL，88%甲酸12.5 mL，六水氯化鋁17.5 g，混勻后，置于250 mL容量瓶中，蒸餾水定容，備用。

1.4 實驗分組及KOA 模型的建立 將40 只SD 雌性大鼠隨機分為4 組，即正常對照組、模型組、AG490組和DUSP19組，每組10只。除正常對照組外，其他3 組均建立KOA 大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，分別于實驗第1、第3、第5 天按0.1 mL/kg 劑量在大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射L-半胱氨酸—木瓜蛋白酶混合液[5]。清除左膝關(guān)節(jié)處大鼠毛發(fā)，彎曲大鼠膝關(guān)節(jié)，消毒后于左側(cè)穿刺，穿刺時注射器通過骸韌鍵進入，針尖向中上傾斜插入膝關(guān)節(jié)腔，注射后碘伏消毒傷口。正常對照組在同一部位注射等量生理鹽水。造模成功12 d后，AG490 組和DUSP19 組分別按0.1 mL/kg 注射JAK2/STAT3 信號通路抑制劑AG490（100 μmol/L）和JAK2/STAT3 信號通路激活劑DUSP19（100 μmol/L）。正常對照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.5 HE染色法觀察滑膜組織病理學(xué)變化 正常喂養(yǎng)4周后處死大鼠，分離左膝關(guān)節(jié)滑膜、股骨髁及脛骨平臺，多聚甲醛溶液固定48 h，取股骨髁及脛骨平臺，置于混合脫鈣液中脫鈣20 d，清水沖洗，連同同一部位的滑膜標本進行浸蠟和包埋，經(jīng)切片機切成5 μm 厚石蠟切片，然后脫蠟、染色、脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

1.6 RT-qPCR 檢測JAK2、STAT3、SCGF-β、VEGF mRNA表達 在大鼠膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚后，分離其肌肉并暴露膝關(guān)節(jié)，再用手術(shù)刀片刮取其中滑膜組織。以GAPDH 作為內(nèi)參，在Light Cycler 480 實時熒光定量PCR 儀上進行PCR 擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性90 ℃，3 min；變性95 ℃，10 s；退火55 ℃，30 s；延伸70 ℃，10 s，共46個循環(huán)，在55 ℃時采集熒光信號。所有引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列如下：JAK2上游5’-TAAATGGAGA AGACGGCCTGA-3’，下 游5’-ACGGTGAAGAGTGATGGACAG-3’；STAT3上游5’-AGGACGCGAGAATGAAGAG-3’，下游5’-TGTTCTCCAGGTCTCCCTGG-3′；VEGF 上游5’-TTGCTGCTCTACCTCCACCAT-3’，下游5’-TGTGCTCTCCTCCTGCCATAG-3’；SCGF-β 上游5’-ATTTAAAACATATGGGTGCTCGGGGAGCAGAGAG-3’，下游5’-ATTGGATCCCTAGAAGGGGAACTCGCAG-3’；GAPDH 上游5’-GTTCAGGAAGAGTGACACCA-3’，下 游5’-TTCTCCGCATCTCCATTCTC-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表量，實驗重復(fù)測量3次。

1.7 Western blotting檢測p-JAK2、p-STAT3、SCGFβ、VEGF 蛋白表達 取各組滑膜組織，加入裂解液RIPA 和PMSF，冰中裂解30 min；4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取上清，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；加入p-JAK2、p-STAT3、SCGF-β、VEGF 一 抗（均 為1∶500），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h；采用化學(xué)發(fā)光試劑盒進行發(fā)光處理，凝膠成像分析系統(tǒng)中采集其發(fā)光圖像，并計算其灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值代表目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；雙變量相關(guān)用Pearson 相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜組織形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組滑膜細胞呈半透明，呈單層或雙層且整齊排列，無血管增生和纖維化現(xiàn)象，無炎細胞浸潤；模型組滑膜細胞表面明顯腫脹、充血且肥厚粗糙，存在炎細胞浸潤，增生活躍，滑膜組織中毛細血管增多且充血明顯；與模型組比較，AG490 組滑膜細胞異常增生、排列情況、炎細胞浸潤均顯著惡化；與模型組比較，DUSP19組滑膜細胞異常增生、排列情況、炎細胞浸潤均顯著改善，見圖1。2.2 4組JAK2、STAT3、SCGF-β、VEGF mRNA相對表達量比較 與正常對照組比較，模型組JAK2、STAT3 mRNA 表達水平顯著降低，SCGF-β、VEGF mRNA 表達水平顯著升高（均P＜0.05）；與正常對照組和模型組比較，AG490 組JAK2、STAT3 mRNA表達水平顯著降低，SCGF-β、VEGF mRNA 表達水平顯著升高（均P＜0.05）；相反地，DUSP19組JAK2、STAT3 mRNA 表達水平顯著升高，SCGF-β、VEGF mRNA表達水平顯著降低（均P＜0.05），見表1。

圖1 大鼠滑膜組織HE染色圖（×400）

表1 4 組JAK2、STAT3、SCGF-β、VEGF mRNA 相對表達量比較 n=10，

表1 4 組JAK2、STAT3、SCGF-β、VEGF mRNA 相對表達量比較 n=10，

與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與AG490組比較，cP＜0.05。

2.3 4 組p-JAK2、p-STAT3、SCGF-β、VEGF 蛋白表達量比較 與正常對照組比較，模型組p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達量顯著降低，SCGF-β、VEGF 蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05）；與正常對照組和模型組比較，AG490 組p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達量顯著降低，而SCGF-β、VEGF 蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05）；DUSP19 組p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達量顯著升高，SCGF-β、VEGF 蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 p-JAK2、p-STAT3、SCGF-β、VEGF蛋白電泳圖

表2 4組p-JAK2、p-STAT3、SCGF-β、VEGF蛋白表達量比較 n=10，

表2 4組p-JAK2、p-STAT3、SCGF-β、VEGF蛋白表達量比較 n=10，

與正常對照組比較，dP＜0.05；與模型組比較，eP＜0.05；與AG490組比較，fP＜0.05。

2.4 相關(guān)性分析 p-JAK2 與SCGF-β、VEGF 表達呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.960、-0.962、P＜0.05）；p-STAT3 與SCGF-β、VEGF 表達亦呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.974、-0.977，P＜0.05）。

3 討論

KOA 病因及發(fā)病機制相對復(fù)雜，與多因素、多層次綜合因素相關(guān)，具體機制目前尚未完全闡明[6～9]。研究表明KOA 在老年人群中患病率高達50%，我國目前60 歲以上人群中已經(jīng)有將近一億人，并且KOA的發(fā)生與年齡、性別、炎癥等因素密切相關(guān)[10-12]。鼠類的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和人類接近，經(jīng)常被選為KOA模型動物，并且SD 大鼠適應(yīng)性和抗病能力強、飼養(yǎng)條件要求簡單、成本低廉、實驗操作要求較低，因此被廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP 等實驗，以往研究應(yīng)用木瓜蛋白酶建立SD 雌性大鼠KOA 模型有成功先例[5]，故本實驗研究選用SD 雌性大鼠木瓜蛋白酶注射的方法作為KOA 模型。本研究結(jié)果顯示，正常對照組組滑膜細胞呈半透明、單層扁平并且整齊排列，無血管增生和纖維化現(xiàn)象，無炎細胞浸潤；模型組滑膜細胞表面明顯腫脹、充血且肥厚粗糙，滑膜細胞呈多層，且排列不整齊，增生活躍，滑膜細胞組織中毛細血管增多且充血明顯，表明KOA模型造模成功。

作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，JAK2/STAT3信號通路不僅參與細胞增殖、分化、調(diào)亡等過程，而且與氧化應(yīng)激、細胞損傷等免疫調(diào)節(jié)生物學(xué)過程有關(guān)。STAT3 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到兩個磷酸化位點的調(diào)節(jié)，包括Tyr705和Ser727位點，活化后（p-STAT3）能誘導(dǎo)多種與細胞分化、調(diào)亡及血管生成等生物學(xué)行為相關(guān)的下游靶基因的表達，而VEGF是STAT3的下游靶基因[13]。p-JAK2、p-STAT3 是JAK2/STAT3 信號通路活化的產(chǎn)物[14]。翁艷等[15]研究表明，AG490 能夠降低激素性股骨頭壞死大鼠滑膜組織中細胞因子JAK2、STAT3 的表達。Yao 等[16]對小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的研究發(fā)現(xiàn)，AK2/STAT3 信號通路激活劑DUSP19 可通過激活JAK2/STAT3 途徑抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和基質(zhì)金屬蛋白酶表達。本研究結(jié)果顯示，模型組JAK2、STAT3 mRNA 及其蛋白磷酸化表達水平顯著低于正常對照組（P＜0.05），說明在KOA 大鼠關(guān)節(jié)病理結(jié)構(gòu)改變過程中JAK2/STAT3信號通路的表達受到抑制，而DUSP19 能明顯升高JAK2、STAT3 mRNA表達及其磷酸化蛋白表達水平，且顯著改善KOA大鼠滑膜細胞異常增生、炎細胞浸潤等情況。

炎性細胞因子與KOA 的診斷是近幾年研究的熱點，主要是針對白介素相關(guān)因子，腫瘤壞死因子以及轉(zhuǎn)化生長因子等促炎性因子[4]。SCGF-β 和VEGF水平與人體炎癥因子機制密切相關(guān)，SCGF-β參與了生殖系統(tǒng)炎癥病變[17]、腦神經(jīng)系統(tǒng)[18]、腰椎間盤突出[19]等的炎癥機制，與炎癥的嚴重程度密切相關(guān)，其表達在KOA 患者中也明顯升高[9]。研究表明，VEGF 促進骨關(guān)節(jié)炎進展的機制在于促進血管內(nèi)皮增殖，促進腫瘤淋巴管生長，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，從而加速滑膜血管翳新生血管形成，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分裂加速，是導(dǎo)致血管通透性增加的重要因素。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，患者多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、軟骨基質(zhì)成分改變，抗血管生成因子減少間接增強了VEGF等促血管生成因子在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組SCGF-β、VEGF表達顯著高于正常對照組，表明SCGF-β、VEGF 與KOA 密切相關(guān)；AG490 組SCGF-β、VEGF mRNA和蛋白表達顯著高于正常對照組和模型組，提示AG490 通過抑制JAK2/STAT3 信號通路活性下調(diào)SCGF-β、VEGF 的表達。同時，本研究相關(guān)性分析顯示，p-JAK2、p-STAT3 與SCGF-β、VEGF的表達呈負相關(guān)關(guān)系，進一步表明JAK2/STAT3 信號通路活化可降低SCGF-β、VEGF的表達。

綜上所述，JAK2/STAT3 信號通路在KOA 大鼠滑膜組織中被抑制，其活化可下調(diào)SCGF-β和VEGF的表達，從而改善KOA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的病理學(xué)形態(tài)。