李世森，杜昆利，劉小娟

空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化外科，西安 710032

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，是全球第4大常見腫瘤，其發(fā)病率和病死率均逐年上升，并趨于年輕化，嚴重危害患者的健康。中國是胃癌高發(fā)地區(qū)，每年胃癌新發(fā)例數(shù)和病死例數(shù)均居全球前列，因此有必要深入探討胃癌發(fā)生機制，探尋可以早期診斷預測胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學指標，具有重要的臨床實際意義。細胞周期蛋白依賴性激酶12（cyclin dependent kinase 12，CDK12）屬于CDK的一種，在調控DNA損傷和應激損傷的細胞應答基因轉錄方面發(fā)揮特定作用。近年來關于CDK12過表達在多種惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺導管癌等中已有報道。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]基因產(chǎn)物是與腫瘤風險相關的重要蛋白，可催化單鏈斷裂的堿基切除修復步驟，在人類癌變DNA修復系統(tǒng)和維持基因組的完整性方面起關鍵作用。早期研究已報道

PARP1

基因多態(tài)性與胃癌易感性有關，同時攜帶

PARP

-1940Lys/Arg和

PARP

-1762Ala/Ala+Val/Ala基因型的個體患胃癌的風險是野生型攜帶者的4.2倍，但近年來關于PARP1在胃癌患者中的表達研究少見報道。因此，本研究通過檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12、PARP1的表達情況，分析其表達水平與患者臨床特征的關系，探究其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年3月至2015年3月于空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院行手術切除治療的76例胃癌患者為研究對象，取其胃癌組織標本及相應癌旁正常胃黏膜組織標本（距離腫瘤組織＞5 cm）。納入標準：①年齡≥18歲，均經(jīng)病理檢查證實為胃癌；②均為首次治療，接受胃癌根治術，且術前未行放療、化療或其他抗腫瘤治療；③臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：①合并其他原發(fā)腫瘤；②不配合隨訪。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個有效的腫瘤數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一個由北京大學開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，二者都是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)分析和可視化的網(wǎng)站，可幫助醫(yī)學科研人員對相關腫瘤基因進行生物標志物鑒定、表達圖譜分析、生存分析等。本研究基于上述兩個數(shù)據(jù)庫，對

CDK12

、

PARP1

mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達差異進行比較。

1.2.2 免疫組化法檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12、PARP 1蛋白表達將石蠟組織標本以4 μm切片，進行脫蠟、水化處理，采取免疫組化EnVision兩步染色法檢測CDK12、PARP1蛋白表達情況，方法步驟按試劑盒說明書操作。一抗采用兔抗人CDK12多克隆抗體、兔抗人PARP1多克隆抗體（均購自美國Sigma公司），二抗采用羊抗兔CDK12、PARP1（均購自美國Abcam公司），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。以已知陽性切片標本為陽性對照，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。結果判定根據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。①按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞為0分，＜25%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。兩種評分方法得分的乘積為最終結果，以最終結果＞2分為陽性表達（+），≤2分為陰性表達（-）。

1.3 隨訪觀察

所有胃癌患者術后均行電話隨訪或門診隨訪，隨訪自手術后第1個月起，截至2020年3月或患者死亡（8～60個月）。第1～2年每1～3個月隨訪一次，第3～4年每6個月隨訪一次，之后每年隨訪一次。觀察胃癌患者在隨訪結束時及隨訪過程中的生存狀況，分析CDK12、PARP1蛋白表達情況與患者生存的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)庫中正常胃黏膜組織和胃癌組織中CDK12、PARP 1 mRNA表達情況的比較

Ualcan數(shù)據(jù)庫顯示，胃癌組織（

n

=415）中

CDK12

mRNA表達水平為19.17（12.47，24.73），高于正常胃黏膜組織（

n

=34）的 9.41（7.52，11.78），差異有統(tǒng)計學意義（

Z

=10.265，

P

＜0.05）；胃癌組織（

n

=415）中

PARP1

mRNA表達水平為65.37（50.09，88.61），高于正常胃黏膜組織（

n

=34）的35.63（28.15，42.20），差異有統(tǒng)計學意義（

Z

=17.923，

P

＜0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，胃癌組織（

n

=408）中

CDK12

、

PARP1

mRNA表達水平分別為（4.17±0.63）、（5.92±0.78），均高于正常胃黏膜組織（

n

=211）的（3.12±0.42）、（4.23±0.59），差異均有統(tǒng)計學意義（

t

=21.827、27.643，

P

＜0.05）。胃癌組織中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA水平呈正相關（

r

=0.15，

P

=0.003）。

2.2 免疫組化法分析胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中CDK12和PARP 1蛋白表達情況的比較

免疫組化結果顯示，CDK12在細胞質和細胞核中均有表達，其中細胞核占多數(shù)，PARP1主要定位于細胞核（圖1）。胃癌組織中CDK12、PARP1陽性表達率分別為81.58%（62/76）、85.53%（65/76），均明顯高于癌旁正常胃黏膜組織中的17.11%（13/76）、21.05%（16/76），差異均有統(tǒng)計學意義（

χ

=63.195、63.459，

P

＜0.01）。

圖1 胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中CDK12和PARP 1蛋白表達情況（免疫組化法，×400）

2.3 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP 1蛋白表達情況的比較

不同年齡、性別、腫瘤大小的胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP1蛋白表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。不同TNM分期、分化程度、淋巴結轉移情況的胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP1蛋白表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中CDK12和PARP 1蛋白表達情況的比較（ n=76）

2.4 生存分析

生存分析結果顯示，CDK12蛋白陽性表達胃癌患者5年生存率為30.65%（19/62），明顯低于CDK12蛋白陰性表達患者的78.57%（11/14），差異有統(tǒng)計學意義（

χ

=10.980，

P

=0.001）；PARP1蛋白陽性表達患者5年生存率為32.31%（21/65），明顯低于PARP1蛋白陰性表達患者的81.82%（9/11），差異有統(tǒng)計學意義（

χ

=7.691，

P

=0.006）。（圖2、圖3）

圖2 CDK12蛋白陽性表達（ n=62）與CDK12蛋白陰性表達（ n=14）胃癌患者的生存曲線

圖3 PARP 1蛋白陽性表達（ n=65）與PARP 1蛋白陰性表達（ n=11）胃癌患者的生存曲線

2.5 胃癌患者預后影響因素的Cox回歸分析

以胃癌患者預后情況為因變量（生存=0，死亡=1），以年齡（＜60歲=0，≥60歲=1）、性別（女=0，男=1）、腫瘤大?。ǎ?.0 cm=0，≥5.0 cm=，）、CDK12蛋白表達（陰性=0，陽性=1）、PARP1蛋白表達（陰性=0，陽性=1）、TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，高/中分化=0）、淋巴結轉移（無=0，有=1）為自變量進行單因素及多因素Cox回歸分析，結果顯示，CDK12蛋白陽性表達、PARP1蛋白陽性表達、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴結轉移是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（

P

＜0.01）。（表2、表3）

表2 胃癌患者預后影響因素的單因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者預后影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

胃癌的早期癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，當出現(xiàn)臨床癥狀時，多數(shù)已發(fā)展為中后期，其難治性主要與腫瘤細胞的轉移、侵襲作用有關。細胞的生命開始于細胞周期，腫瘤細胞亦然，細胞周期的正常運行依賴于精確的調控機制。目前已發(fā)現(xiàn)的參與細胞周期調控的分子有3大類：細胞周期蛋白、CDK以及CDK抑制劑，其中CDK是調控的核心。大量研究發(fā)現(xiàn)，有90%左右的腫瘤存在CDK活性增強，CDK調控異?？勺鳛槟[瘤發(fā)生的標志。研究發(fā)現(xiàn)，CDK12定位于人體染色體17p12上，包含一個相對保守的激酶域（kinase domain，KD），KD可介導RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化。CDK12在人體內普遍表達，其中生殖組織、內分泌組織、骨髓、脾臟等組織器官中CDK表達較高，且主要表達于細胞核。本研究結果顯示，CDK12在胃癌組織中主要定位于細胞核，其陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，表明CDK12在胃癌組織中過表達，可能發(fā)揮致癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)，CDK12/cyclin K復合物在Ser2位點磷酸化RNA聚合酶Ⅱ，是轉錄開始到延伸的關鍵環(huán)節(jié)；敲除

CDK12

或

cyclin K

導致細胞對DNA損傷反應敏感，提示CDK12/cyclin K在DNA損傷修復（DNA damage repair，DDR）及損傷應答中起重要調控作用。本研究結果顯示，CDK12蛋白表達水平與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，與Ualcan、GEPIA數(shù)據(jù)庫中

CDK12

mRNA表達趨勢一致，然而未觀察到CDK12蛋白表達與胃癌患者年齡、性別的相關性，可能基因與蛋白水平存在一定差異。C-C趨化因子配體21（C-C motif chemokine ligand 21，CCL21）可能是 CDK12的下游效應基因，CCL21可調節(jié)腫瘤細胞和免疫細胞生物學功能，誘導免疫應答激活，與腫瘤浸潤和淋巴結轉移有關，推測CDK12可能通過CDK12/CCL21通路參與胃癌腫瘤細胞的惡性功能調節(jié)和免疫微環(huán)境調節(jié)，影響胃癌腫瘤細胞的增殖分化、侵襲轉移過程，具體作用機制有待進一步研究。PARP1是PARP家族表達最豐富、研究最多的一種，由N末端的DNA結合域（DNA-binding domain，DBD）、中間的自身修飾結構域（self modification domain，SMD）和C末端的催化結構域（catalytic central domain，CCD）組成，PARP1通過DBD中的2個鋅指結構識別單鏈或雙鏈斷裂DNA并與之結合發(fā)揮修復作用。生理狀態(tài)下的PARP1活性較低，當接收到機體應激信號時可引起生物活性增加，感知并轉導不同信號，通過磷酸化、乙?；?、泛素化或糖基化修飾作用與相應靶蛋白結合，參與DNA修復、基因轉錄、基因組完整性維持、細胞分裂凋亡、炎性因子表達等生理過程。國內學者張頂頂?shù)妊芯繄蟮溃琍ARP1在激活后，與DNA結合可調控腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子表達，通過上調血管壁外膜炎癥反應參與調控顱內動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展及破裂，揭示了PARP1與炎癥因子的作用關系。另有研究指出，PARP1過度激活會導致染色體DNA大量斷裂，并觸發(fā)一種固有的依賴于PARP1的細胞死亡程序，該程序廣泛存在于多種器官系統(tǒng)中。本研究結果顯示，PARP1主要表達于胃癌組織細胞的細胞核中，其在腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，推測胃癌組織及細胞中PARP1細胞死亡程序被過度激活，DNA遭到大量破壞，細胞周期調控異常，使得腫瘤細胞過度增殖，導致患者病情惡化。另外，PARP1蛋白表達與胃癌組織分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關，表明PARP1可能參與胃癌細胞侵襲、轉移過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中CDK12和PARP1表達呈正相關，與GEPIA數(shù)據(jù)庫中

CDK12

mRNA和

PARP1

mRNA在胃癌組織中表達趨勢一致，推測二者可能發(fā)揮協(xié)同作用調控DNA的轉錄，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進程，具體作用機制尚不清楚。生存分析結果顯示，CDK12、PARP1蛋白陽性表達胃癌患者5年生存率均明顯低于陰性表達患者，Cox分析顯示CDK12蛋白、PARP1蛋白陽性表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，表明CDK12、PARP1表達與胃癌患者生存預后有關，可能作為提示胃癌患者預后不良的潛在生物標志物。有研究顯示，PARP抑制劑對治療

CDK12

缺失患者具有重要意義，或可對臨床治療提供重要參考依據(jù)，因此關于兩者的具體作用機制有待后續(xù)進一步研究。

綜上所述，CDK12、PARP1蛋白在胃癌組織中呈高表達，其表達與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移及不良預后有關，二者可能共同作用在基因轉錄水平參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進程。