田佳樂，劉 洋，李嘉雯，喬少婷，胡海敏，丹 彤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是一種低GC 含量、兼性厭氧、過氧化氫酶陰性、同型發(fā)酵的乳酸菌[1]。嗜熱鏈球菌在發(fā)酵牛乳時(shí)具有生長繁殖快、發(fā)酵酸化活力高、產(chǎn)香等特性。此外，部分菌株能代謝培養(yǎng)基中的碳源生產(chǎn)胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）[2]。EPS 是乳酸菌重要的次生代謝產(chǎn)物，依附于微生物細(xì)胞壁形成莢膜多糖或進(jìn)入培養(yǎng)基形成黏液多糖[3]。EPS 在提高乳制品黏度、質(zhì)地和口感等方面發(fā)揮著重要作用[4]，其中一些EPS 還具有抗腫瘤[5]、降低膽固醇[6]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[7]、抗氧化[8-9]、調(diào)節(jié)腸道菌群生長因子[10]、抑制病原微生物[11]等功能。

乳酸菌的EPS 生物合成由eps基因簇調(diào)控，決定EPS 重復(fù)單元的合成、聚合、輸出等過程[12-13]。Shan 等[14]、Stingele 等[15]和Luo 等[16]發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌ASCC1275 在培養(yǎng)基中能同時(shí)產(chǎn)生莢膜多糖和黏液多糖，這主要是因?yàn)閑ps基因簇中有2 對(duì)控制鏈長基因，即eps1C-eps1D和eps2C-eps2D；Delcher 等[17]將轉(zhuǎn)座子插入到嗜熱鏈球菌eps基因簇上，發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)座子的突變株失去了合成EPS的能力，說明eps基因簇在EPS 生物合成中發(fā)揮著重要作用。

嗜熱鏈球菌IMAU20756 分離自蒙古國烏蘭巴托市海日瑪特蘇木酸牛奶中，在M17 液體培養(yǎng)基中EPS 產(chǎn)量為197.02 mg/L。本試驗(yàn)采用二代測序技術(shù)（Illumina Hiseq 4000）對(duì)嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組進(jìn)行測序，找出與EPS 生物合成相關(guān)的基因簇，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（Real-time fluorescent quantitative PCR，RTqPCR）分析eps基因在菌體生長不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，為解析乳酸菌EPS 生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜熱鏈球菌IMAU20756 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

cDNA 合成試劑盒、qPCR 合成試劑盒（SYBR Green），天根生化科技（北京）有限公司；通用型RNA 提取試劑盒，集思慧遠(yuǎn)生物公司；M17 肉湯培養(yǎng)基，海博生物公司。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

AR2202CN 型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；HA-300M 型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，日本HIRAYAMA 公司；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋、LRH-250 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；ZHJH-C1214C 型超凈臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；BX50 型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯（OLYMPUS）；Vortex-genie2 型漩渦振蕩器，美國Scientific Industries 公司；5810R 型高速控溫離心機(jī)、移液器，德國Eppendorf 公司；Nano-Drop2000 型微量分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組測序

1.4.1.1 菌株DNA 提取 將真空冷凍干燥保藏的菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中活化，然后在M17 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)活化2 代并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，接種量為2%。其中每次傳代均需進(jìn)行革蘭氏染色和顯微鏡觀察，在確保無污染的前提下，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。最后將第3 代M17 液體培養(yǎng)液離心（3 000×g，5 min），并收集菌體，收集的菌體采用OMEGA-D3392 基因組DNA 提取試劑盒提取樣品中基因組DNA，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 DNA 質(zhì)控及基因組重測序 完成基因組DNA 抽提后，采用微量分光光度計(jì)測定DNA 的濃度，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷基因組DNA 的純度和完整度，并對(duì)質(zhì)量合格的DNA 液采用Illumina Hiseq 4000 進(jìn)行二代基因組重測序。

1.4.1.3 基因組拼接組裝 首先，將Illumina Hiseq 4000 高通量測序平臺(tái)獲得的嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組重測序數(shù)據(jù)過濾；其次，利用SOAPdenovo 程序包[18]選取合適的kmer 值，對(duì)過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝和單堿基校正。以基因組大小、腳手架數(shù)量、N50 長度、N90 長度、GC 含量值為指標(biāo)，對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，最后選取腳手架數(shù)量較小、N50 和N90 較長的序列進(jìn)行后續(xù)soap驗(yàn)證及校驗(yàn)。

1.4.1.4 功能基因的預(yù)測及注釋 采用Glimmer v3.02 軟件[19]（http：//www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/）進(jìn)行基因預(yù)測，獲得開放閱讀框信息。結(jié)合RAST（Rapid annotation using subsystem technology）Server-RAST Annotation Server（http：//rast.nmpdr.org/）網(wǎng)上在線工具和COG（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /COG/）數(shù)據(jù)庫，完成對(duì)嗜熱鏈球菌基因組的預(yù)測與注釋。

1.4.1.5 生物信息學(xué)分析 核酸序列相似性比較采用NCBI 的BLAST 軟件在線分析（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov），多序列比對(duì)采用ClustalW 程序在線分析（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/）。

1.4.2 嗜熱鏈球菌IMAU20756 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)所用引物均采用Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 本試驗(yàn)所用引物Table 1 The primers used in this experiment

1.4.2.2 嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌株培養(yǎng)及菌體收集 將嗜熱鏈球菌IMAU20756 按2%接種量接種于M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別于6，12，18，24 h 收集菌體，可直接提取總RNA 或于-80 ℃凍存。

1.4.2.3 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA 合成 取5 mL 菌液離心去上清（5 000×g，6 min），加入RNAiso Plus 試劑提取樣品總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量?；蚪MDNA 的去除和cDNA 的合成使用PrimeScriptTMRT 試劑盒?；蚪MDNA 的去除反應(yīng)條件為42 ℃，2 min；反轉(zhuǎn)錄cDNA 合成的反應(yīng)條件為：50 ℃，15 min，85 ℃，5 s。

1.4.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)eps基因簇5’端deoD到3’端orf14.9之間的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，再以從嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌體細(xì)胞中提取的DNA 為初始模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，即用Taq 酶擴(kuò)增eps基因簇并對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定及測序。本試驗(yàn)參照基因使用的是gapdh，miRNA 反應(yīng)體系的配置（總體積20 μL）如表2所示。1.4.2.5 反應(yīng)程序 兩步法熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s；60 ℃復(fù)性并延伸34 s，其中變性、復(fù)性、延伸進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)程序結(jié)束后95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s 連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度。

表2 miRNA 反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of miRNA

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組基本特征

經(jīng)檢測，嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組全長為1 838 440 bp，GC 含量為38.8%，共編碼了2 120 個(gè)基因，包含1 962 個(gè)功能基因、36 個(gè)tRNA、515 個(gè)假基因、1 個(gè)tmRNA 和2 個(gè)重復(fù)單位。其中和EPS 生產(chǎn)相關(guān)的基因有12 個(gè)，分別為epsA（1 460 bp）、epsB（732 bp）、epsC（692 bp）、epsD（692 bp）、eps1E（1 367 bp）、eps2E（251 bp）、epsG（491 bp）、epsF（917 bp）、epsH（1 112 bp）、epsI（896 bp）、epsJ（977 bp）、epsK（1 442 bp）。

2.2 嗜熱鏈球菌IMAU20756 胞外多糖基因簇

通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌IMAU20756 基因組中與產(chǎn)EPS 相關(guān)的基因有12個(gè)（圖1）。在基因簇5' 端是deoD，為嘌呤核苷磷酸化酶，主要參與核苷酸的生物合成和分解代謝[20]，基因簇3'端是orf14.9，主要參與嗜熱鏈球菌細(xì)胞的生長[21]，epsA、epsB是調(diào)控基因，epsC、epsD決定多糖鏈長，eps1E、eps2E、epsG、epsF、epsH、epsI、epsJ是糖基轉(zhuǎn)移酶基因，負(fù)責(zé)將單糖轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體上構(gòu)成重復(fù)單位，其中eps1E、eps2E編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，epsF編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因，epsK編碼多糖聚合及輸出。

圖1 嗜熱鏈球菌IMAU20756 eps基因簇Fig.1 The eps gene cluster of S.thermophilus IMAU20756

2.3 嗜熱鏈球菌IMAU20756 胞外多糖基因簇分析

利用NCBI Blast 在線搜索嗜熱鏈球菌IMAU20756 產(chǎn)EPS 生物合成的相關(guān)基因并預(yù)測基因功能，所得部分結(jié)果如表3所示。由表可知，位于基因簇5' 端deoD編碼嘌呤核苷磷酸化酶，該酶與嗜熱鏈球菌NWC1 菌株的嘌呤核苷磷酸化酶（ID：CP02925.1）及嗜熱鏈球菌CS8 菌株的嘌呤核苷磷酸化酶（ID：CP016439.1）均具有較高同源性，達(dá)到98.73%，與嗜熱鏈球菌S9 菌株（ID：CP013939.1）的同源性達(dá)到98.59%。epsA與嗜熱鏈球菌ASCC1275 菌株epsA（ID：CP006819.1）具有極高同源性，達(dá)到100%，該基因是LytR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包含短的信號(hào)錨定區(qū)域，由N 末端的胞漿區(qū)和跨膜區(qū)組成，與莢膜多糖的產(chǎn)量密切相關(guān)[22]。epsB為酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因，epsD為酪氨酸蛋白激酶基因，它們與嗜熱鏈球菌ASCC1275 菌株的epsB及eps1D同源性分別達(dá)到100%和93%；另外，epsA還與嗜熱鏈球菌STCH41 菌株的epsA（ID：MK483531.1）同源性達(dá)到98.97%，epsB與該菌株的epsB同源性達(dá)到99.04%。epsC負(fù)責(zé)調(diào)控EPS 鏈長度，與嗜熱鏈球菌STCH19 和STCH38 中的epsB（ID：MK483538.1）有較高的同源性（同源性分別為99.86%與99.42%）。eps1E、eps2E、epsF是編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，負(fù)責(zé)EPS 寡糖重復(fù)單元的合成，其中，eps1E編碼半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因，與嗜熱鏈球菌LMG18311（ID：CP000023.1）菌株半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶及嗜熱鏈球菌STCH39（ID：MK483550.1）菌株的半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源性都達(dá)到99.85%，eps2E與嗜熱鏈球菌STCH13（ID：MK483559.1）及嗜熱鏈球菌STCH38 的半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的同源性都達(dá)到85.84%。epsF基因是鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，與嗜熱鏈球菌LMG18311 鼠李糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源性達(dá)到96.89%，與嗜熱鏈球菌STCH13菌株的鼠李糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源性達(dá)到96.67%。epsG是嗜熱鏈球菌IMAU20756 特有的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，與其它乳酸菌eps基因簇的同源性較低，如與嗜熱鏈球菌LMG18311 全基因組同源性為82%，與嗜熱鏈球菌STCH13 的eps基因簇同源性僅為66%。

表3 嗜熱鏈球菌IMAU20756 胞外多糖合成基因簇基因功能預(yù)測Table 3 Gene function prediction of extracellular polysaccharide synthesis gene cluster of S.thermophilus IMAU20756

2.4 嗜熱鏈球菌IMAU20756 總RNA 質(zhì)量評(píng)定

RNA 的質(zhì)量是影響基因表達(dá)結(jié)果的重要因素。表4 是總RNA 的OD 值（260nm/280nm，260nm/230nm），圖2 是RNA 在1%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。樣品RNA 的OD260nm/OD280nm比值在2.20～2.23 之間，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果清晰地顯示23S 亞基（上）和16S 亞基（下）條帶，這些結(jié)果說明RNA 降解程度較小，質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖Fig.2 The result of agarose gel electrophoresis

表4 總RNA 提取結(jié)果Table 4 The extraction results of total RNA

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果分析

嗜熱鏈球菌IMAU20756 和EPS 生產(chǎn)相關(guān)的12 個(gè)基因不同時(shí)間點(diǎn)（6，12，18，24 h）的表達(dá)結(jié)果如圖3所示。epsA、epsB基因表達(dá)量在6 h 達(dá)到峰值，12 h 開始出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，24 h 其表達(dá)量顯著降低，epsC、epsD基因表達(dá)量也有相同的增減趨勢(shì)，說明嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌株在6 h 時(shí)EPS 合成量較多，隨后呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)；eps1E、eps2E編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在發(fā)酵6 h 時(shí)其表達(dá)量達(dá)到峰值，12 h 呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，24 h 時(shí)表達(dá)量降至最低；epsF是編碼鼠李糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其表達(dá)量也在6 h 時(shí)達(dá)到峰值，24 h降至最低；epsG、epsH、epsI、epsJ均為調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶基因，整體呈現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)，而epsJ基因在6 h 至12 h 有增多趨勢(shì)，隨后開始下降。另外epsK基因調(diào)控EPS 的聚合及輸出，其在6 h 至18 h 呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的增長趨勢(shì)，說明這一階段EPS 在不斷的延伸、聚合，并分泌至培養(yǎng)基中。

圖3 嗜熱鏈球菌IMAU20756 eps基因簇在菌體生長不同階段相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of eps gene cluster of S.thermophilus IMAU20756 in different time

2.6 嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌株eps1E 多序列比對(duì)

乳酸菌EPS 的生物合成是由eps基因簇調(diào)控。這些基因簇一般含有多個(gè)基因，分別控制著EPS 的合成、聚合以及向細(xì)胞外的輸出。重復(fù)單位的合成是在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下將糖核苷酸順序性轉(zhuǎn)移到異戊二烯醇磷酸酯（脂載體）上形成的[23]。在eps基因簇中一般含有多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，其中，負(fù)責(zé)將第一個(gè)糖基供體轉(zhuǎn)運(yùn)到脂質(zhì)攜帶體上的糖基轉(zhuǎn)移酶被稱為引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶[24]。引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶是合成 EPS 重復(fù)單元的第一步，在EPS 合成過程中發(fā)揮著重要的作用。

嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌株eps基因簇長度為1 838 440 bp，與EPS 生產(chǎn)相關(guān)的基因有12個(gè)，分別控制著EPS 的合成、聚合及向細(xì)胞外的輸出。其中，eps1E、eps2E、epsG、epsF、epsH、epsI、epsJ編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，負(fù)責(zé)將單糖轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體上構(gòu)成重復(fù)單位。應(yīng)用ClustalW 在線多序列比對(duì)將eps1E、eps2E、epsG、epsF、epsH、epsI、epsJ等糖基轉(zhuǎn)移酶基因分別與乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NIZO B40、肺炎鏈球菌血清型（Streptococcus pneumoniaeserotype）14、嗜熱鏈球菌Sfi6、乳酸乳球菌NIZO B35 的引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在eps1E的氨基酸序列中，含有引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶所共有A、B 和C 保守區(qū)存在（如圖4所示）。其中A、B 區(qū)被認(rèn)為是催化磷酸糖向脂載體轉(zhuǎn)移的功能區(qū)，C 區(qū)的功能是決定所轉(zhuǎn)移糖基的特異性[25]。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，可以得出eps1E可能是引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。嗜熱鏈球菌IMAU20756 生產(chǎn)的EPS 主要由EPS-1a 和EPS-3a 兩種多糖混合而成，EPS-1a主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖構(gòu)成，三者的摩爾比為3.62∶1∶2.99；EPS-3a 主要由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成，其摩爾比為1.19∶1∶1.08（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。eps1E編碼半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因，說明在重復(fù)單位的合成過程中，eps1E將UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體上，然后其它糖基轉(zhuǎn)移酶陸續(xù)將葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)到和脂載體相連的糖基上，構(gòu)成EPS 的主鏈。

圖4 嗜熱鏈球菌IMAU20756 菌株eps1E 多序列比對(duì)Fig.4 eps1E multisequence alignment of S.thermophilus IMAU20756 strain

引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖轉(zhuǎn)運(yùn)到脂載體上，是構(gòu)成EPS 生物合成的第一步，在基因工程中具有重要意義。例如Dabour 等[26]報(bào)道了當(dāng)乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactissubsp.cremoris）SMQ- 461 的起始糖基轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生突變時(shí)，該菌株失去了生產(chǎn)EPS 的能力，證明該酶是調(diào)控EPS 生產(chǎn)的關(guān)鍵酶。類似的結(jié)果發(fā)生在Lebeer等[22]報(bào)道的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG 中的welE基因中，將引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除后，和野生菌株對(duì)比突變株分泌到環(huán)境中的EPS 減少甚至是終止了EPS 的產(chǎn)生。利用基因工程方法在產(chǎn)EPS 的菌株中導(dǎo)入糖基轉(zhuǎn)移酶基因，可產(chǎn)生特定新型的EPS，這些方法的實(shí)施有助于提高EPS 在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用二代測序技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)高產(chǎn)EPS 的嗜熱鏈球菌IMAU20756進(jìn)行基因組測序并對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)eps基因表達(dá)量定量分析發(fā)現(xiàn)該菌株基因組全長為1 838 440 bp，GC 含量為38.8%，共編碼2 120 個(gè)基因，包含1 962 個(gè)功能基因，36 個(gè)tRNA、515 個(gè)假基因、1個(gè)tmRNA 和2 個(gè)重復(fù)單位。其中和EPS 生產(chǎn)相關(guān)的基因有12 個(gè)，epsA、epsB是調(diào)控基因，epsC、epsD決定多糖鏈長，eps1E、eps2E、epsG、epsF、epsH、epsI、epsJ是編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，epsK調(diào)控多糖聚合及輸出。所有和EPS 生物合成相關(guān)的基因在發(fā)酵過程中均能表達(dá)，特別是糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)量在發(fā)酵6 h 時(shí)達(dá)最高。