陳姝琴，王興欣，趙娟娟，紀(jì)澤敏，趙煥虎

（民族醫(yī)藥教育部重點實驗室 中央民族大學(xué)藥學(xué)院 北京100081）

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是指人體內(nèi)脂質(zhì)代謝障礙導(dǎo)致體內(nèi)血脂異常，從而嚴(yán)重危害人體健康的疾病。高脂血癥可引起動脈粥樣硬化，是心血管疾病的主要危險因素之一[1]。降低膽固醇的藥物主要通過抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，加速低密度脂蛋白膽固醇的分解或減少腸道內(nèi)膽固醇的吸收，如他汀類藥物，雖然這些藥物療效確切，但是具有肝功能受損等副作用[2-3]。

人體內(nèi)的微生物數(shù)量是人類細(xì)胞數(shù)的10 倍，其中腸道菌群的多樣性由遺傳和環(huán)境因素等共同決定[4]。腸道菌群通過產(chǎn)生代謝物影響宿主的代謝和健康，其中，主要通過短鏈脂肪酸、膽汁酸、氨基酸、內(nèi)毒素等作用影響宿主的脂質(zhì)代謝[5-7]。

大多關(guān)于高脂血癥的研究停留在實驗室階段，臨床試驗還很少。有研究通過16S rDNA 測序技術(shù)分析不同物質(zhì)對高脂血癥大鼠或小鼠腸道菌群的影響[8-12]，而針對人的研究較少，具體的機制還需研究確認(rèn)。

本研究對高脂血癥患者與非高脂血癥人群的腸道菌群進行高通量測序分析，利用逆處理概率加權(quán)法（Inverse probability of treatment weighting，IPTW法）校正混雜因素，通過QIIME2 ANCOM 找出高脂血癥患者與非高脂血癥人群之間的差異腸道菌群，并通過R Tax4Fun 包進行功能預(yù)測。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本及納入標(biāo)準(zhǔn)

本研究獲得中央民族大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。132 例受試者樣本均來自中央民族大學(xué)校醫(yī)院參與慢性病體檢和大腸癌篩查的教職工臨床病例樣本，均簽署書面知情同意書。排除以下情況的人群：具有精神病史，濫用藥物的人群；有手術(shù)或其它應(yīng)急情況的人群；近期服用過抗生素或益生菌的人群（3 個月）；長期服用類固醇激素、甲狀腺激素、避孕藥和影響血清脂質(zhì)參數(shù)的藥類。根據(jù)《中國成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，符合其中一項或多項診斷為高脂血癥：1）總膽固醇＞5.20 mmol/L；2）低密度脂蛋白膽固醇＞3.4 mmol/L；3）甘油三酯＞1.7 mmol/L；4）高密度脂蛋白膽固醇≤1.0 mmol/L[13-14]。

1.2 糞便樣本采集、DNA 提取

采集受試者糞便樣本，加入生理鹽水，立即放在冰上進行分裝、標(biāo)記。每管樣本300 mg，-80 ℃儲存。根據(jù)強力土壤?DNA 提取試劑盒操作步驟提取DNA。分光光度計檢測DNA 的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，檢測合格的DNA 于-80 ℃冰箱儲存待用[15]。

1.3 儀器與試劑

正向引物、反向引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司；4 種核苷酸、高保真DNA 聚合酶，美國EpochBiolabs 生物技術(shù)公司；DNA 純化磁珠、DNA純化試劑盒，上海百研生物科技有限公司；強力土壤?DNA 提取試劑盒，深圳安必勝科技有限公司；100 bp DNA 分子量標(biāo)記、標(biāo)記基因、去離子水，天根生化科技（北京）有限公司；無水乙醇，北京化工廠；Q5 超高保真DNA 聚合酶，新英格蘭生物實驗室公司；快速PCR 熱啟動超高保真DNA 聚合酶、DNA 聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；KoDFX，東洋紡（上海）生物科技有限公司。

1795 微型離心機，天根生化科技（北京）有限公司；BC/BD-629HK 臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜、HYC-360 冰箱，海爾集團；G560E 振蕩器，德國西門子股份公司；9902 96 well PCR，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；5424EQ766751 24 孔離心機，德國艾本德股份公司。

1.4 16S rDNA 擴增與高通量測序

16S rDNA 的V3～V4 區(qū)PCR 擴增的上游引物為308F（5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），下游引物為806R（5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。反應(yīng)體系（50 μL）：10 μL 緩沖液，0.2 μL Q5 高保真聚合酶，10 μL GC 增強劑，10 μmol/L 上游引物，10 μmol/L 下游引物，1 μL dNTPs，60 ng 基因組DNA，用ddH2O 補充至總體系50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，退火時間30 s，退火溫度從95 ℃到50 ℃，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠純化，目標(biāo)區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物進行二次PCR擴增，最終的PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化、Nanodrop 2000 定量，瓊脂糖凝膠（1.8%）電泳切膠回收，質(zhì)量合格的文庫用Illumina HiSeq 2500（2×250）測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)以FASTQ 文件格式儲存。用R 軟件DADA2 包對原始數(shù)據(jù)量進行質(zhì)量評估和去噪，去除和校正低質(zhì)量序列，算法識別嵌合體，生成 擴增序列變體（ASV）表，代表序列比對Silva 參考數(shù)據(jù)庫（Silva 123）[16]得到分類信息。物種組成分析、Alpha 多樣性和Beta 多樣性分析均基于自行編寫的腳本在R 軟件上實現(xiàn)。通過QIIME2 ANCOM 找到差異ASVs[17]。功能預(yù)測分析由R Tax4Fun 包完成[18]。預(yù)測的功能主要包括Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫中的基因。

1.6 統(tǒng)計分析

運用SPSS 25 對HLP 組與對照組進行獨立樣本t檢驗。運用R 對HLP 組與對照組除總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白以外的年齡、性別、舒張壓、收縮壓等臨床指標(biāo)進行IPTW 處理，校正混雜因素[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 組間臨床信息與IPTW

本研究共包括94 例高脂血癥人群和38 例非高脂血癥人群。通過獨立樣本t檢驗（表1），膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用IPTW法校正混雜因素，用標(biāo)準(zhǔn)差（Standardized mean differences，SMD）來衡量傾向性評分匹配（Propensity score matching，PSM）和IPTW 的結(jié)果。在IPTW 方法中，所有協(xié)變量的SMD 都小于0.1（圖1）。

圖1 傾向性評分匹配和逆處理概率加權(quán)的病例基線特征Fig.1 Baseline characteristics in case and control by PSM and IPTW

表1 132 例樣本臨床資料統(tǒng)計（±s）Table 1 Clinical information of 132 samples（±s）

表1 132 例樣本臨床資料統(tǒng)計（±s）Table 1 Clinical information of 132 samples（±s）

注：*. P<0.05；**. P<0.01。

特征描述分類對照組高尿酸血癥組統(tǒng)計量P 值性別男1537t= -0.0120.991女2357膽固醇（4.23±0.505）mmol/L（5.6±0.992）mmol/L8.1090.001**高密度脂蛋白（1.44±0.268）mmol/L（1.43±0.369）mmol/L-0.0780.938低密度脂蛋白（2.46±0.465）mmol/L（3.6±0.762）mmol/L8.6530.00**甘油三酯（1.1±0.31）mmol/L（2.22±1.312）mmol/L5.2330.00**舒張壓（79.34±10.963）mmHg（80.04±10.410）mmHg0.3450.731收縮壓（143.11±21.896）mmHg（136.65±17.558）mmHg-1.7780.078體重指數(shù)（23.58±6.420）（25.37±5.580）1.5970.113腰臀比（0.83±0.208）（0.84±0.166）0.2880.774年齡（70.92±9.178）（68.1±10.251）-1.4760.142葡萄糖（6.2±1.175）mmol/L（6.41±1.775）mmol/L0.6890.492谷丙轉(zhuǎn)氨酶（22.53±9.363）U/L（24.53±16.319）U/L0.7110.479肌酐（72.32±17.521）mmol/L（72.63±18.085）mmol/L0.0910.928血尿素氮（5.89±1.410）mmol/L（5.47±1.334）mmol/L-1.6140.109尿酸（329.11±71.728）μmol/L（353.91±86.532）μmol/L1.5630.121同型半胱氨酸（12.79±3.943）μmol/L（13.89±5.252）μmol/L1.1550.250

2.2 測序數(shù)據(jù)與評估

利用R 軟件DADA2 包生成的ASV 表，共有20 295 個ASVs。最小reads 為24 642（圖2a），每個稀疏曲線趨于平坦，最小樣本量為131（圖2b），此后物種積累曲線趨于平緩，過濾后，還剩4 561個ASVs。

圖2 稀釋曲線（a）和物種累計曲線（b）Fig.2 Rarefaction curve（a）and species accumulation curve（b）

2.3 腸道菌群的物種組成分析

在不同的分類水平（門、綱、目、科、屬）對腸道菌群進行物種組成分析，共鑒定10 個門，212 個屬。門水平上（圖3a），HLP 組中擬桿菌門（47.75%vs.41.00%）高于對照組，厚壁菌門（45.25% vs.50.04%）、放線菌門（6.58% vs.8.54%）低于對照組。屬水平上（圖3b），平均相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬中，HLP 組中的擬桿菌屬（36.08% vs.30.46%）、普氏菌屬（7.53% vs.5.50%）、毛螺菌屬（4.21% vs.2.26%）、Agathobacter（3.75% vs.3.28%）、Lachnoclostridium（3.35% vs.3.07%）含量高于對照組，糞桿菌屬（6.63% vs.8.74%）、雙歧桿菌屬（5.60% vs.6.86%）、Subdoligranulum（1.65% vs.3.43%）、瘤胃菌屬（1.09% vs.2.33%）、Alistipes（1.44% vs.2.25%）含量低于對照組。

圖3 組間菌群門（a）、屬（b）水平相對豐度柱狀圖Fig.3 Bar plots of the relative abundances of gut microbiota at phylum（a）and genus（b）level

2.4 菌群多樣性分析

Alpha 多樣性分析顯示，HLP 組的物種多樣性雖低于對照組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（辛普森指數(shù)：P=0.065，香農(nóng)指數(shù)：P=0.13，逆辛普森指數(shù)：P=0.065，Chao1 指數(shù)：P=0.37）（圖4）?；趈accard距離矩陣和bray-curtis 距離矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維標(biāo)度（NMDS）分析未發(fā)現(xiàn)明顯的聚類，adonis 檢驗顯示，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖4 Alpha 多樣性分析Fig.4 Comparison of α-diversity indexes

2.5 高脂血癥的差異菌群分析

在高脂血癥組和非高脂血癥組，利用QIIME2 ANCOM 共找到 7 個差異 ASVs（ASV_232、ASV_63、ASV_173、ASV_46、ASV_393、ASV_283、ASV_41）。ANCOM 的結(jié)果用W值來衡量組間差異顯著性，W值越高代表該物種在組間的差異顯著性越高。其中ASV_232 屬于放線菌門的雙歧桿菌屬，ASV_63、ASV_173 屬于厚壁菌群的糞桿菌屬，ASV_46、ASV_393、ASV_41 屬于擬桿菌門的擬桿菌屬，ASV_283 屬于厚壁菌門的瘤胃菌屬（表2，圖6）。

圖6 高脂血癥組和非高脂血癥組的差異ASVsFig.6 Differential ASVs between the hyperlipidemia group and the non-hyperlipidemia group

表2 高脂血癥組和非高脂血癥組的差異擴增序列變體Table 2 Differential ASVs between the hyperlipidemia group and the non-hyperlipidemia group

以甘油三酯（TG）、膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）為分組指標(biāo)，通過QIIME2 ANCOM 尋找差異ASV。在CHO 組和LDC-C 組未找到差異ASV。在TG 組和非TG 組中，有一個差異ASV（ASV_422），其W值為2 167，屬于厚壁菌門的毛螺菌科，未注釋到屬（圖7）。

圖7 甘油三酯組和非甘油三酯組的差異ASVFig.7 Differential ASVs between the TG group and the non-TG group

在HDL-C 組和非HDL-C 組中，共有18 個差異ASVs（ASV_9、ASV_15、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_56、ASV_80、ASV_99、ASV_153、ASV_45、ASV_636、ASV_243、ASV_109、ASV_516、ASV_13、ASV_74、ASV_96、ASV_259），其中ASV_9、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_80、ASV_99、ASV_45、ASV_243、ASV_516 均屬于擬桿菌門的擬桿菌屬；ASV_15 屬于厚壁菌門的Agathobacter屬；ASV_56、ASV_636 屬于厚壁菌門的Subdoligranulum屬；ASV_153、ASV_74 分別屬于厚壁菌門的疣微菌科、毛螺菌科，未注釋到屬水平；ASV_109 和ASV_13 均屬于厚壁菌門的毛螺菌科的Lachnoclostridium屬；ASV_96 和ASV_259 均屬于厚壁菌門的Lachnospiraceae_UCG-010 屬（表3，圖8）。

圖8 高密度脂蛋白膽固醇組和非高密度脂蛋白膽固醇組的差異ASVsFig.8 Differential ASVs between the HDL-C group and the non-HDLC-C group

表3 HDL-C 組和非HDL-C 組的差異ASVsTable 3 Differential ASVs between the HDL-C group and the non-HDL-C group

2.6 高脂血癥患者與對照組腸道菌群功能比較

對菌群進行功能預(yù)測分析，在KO1 水平上，代謝所占的相對豐度較高。在KO2 水平上共鑒定到41 個KEGG 通路，其中碳水化合代謝物通路所占的相對豐度較高，HLP 組高于對照組，無統(tǒng)計學(xué)意義差異。其次是氨基酸代謝通路，HLP 組低于對照組，也無顯著差異。在KO3 水平上共鑒定到275 個KEGG 通路，ABC轉(zhuǎn)運體所占的相對豐度最高，HLP 組低于對照組，其次是雙組份系統(tǒng)，HLP 組高于對照組。

圖9 組間功能預(yù)測比較分析Fig.9 Comparison of functional predictions between two groups

3 討論

高脂血癥是一種由于人體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致脂質(zhì)水平異常的代謝性疾病[1]，多數(shù)調(diào)脂藥物都有肝功能受損等副作用。隨著腸道菌群研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有重要的生理功能，且腸道菌群與多種疾病密切相關(guān)[1-3]。

本研究基于132 例臨床樣本，通過16S rDNA測序技術(shù)分析高脂血癥患者與非高脂血癥人群腸道菌群，找到差異菌群。

基于R DADA2 包生成ASVs 表，并對測序數(shù)據(jù)進行評估，過濾后還剩4 561 個ASVs，結(jié)果更接近真實情況。通過IPTW法校正混雜因素，使其達(dá)到臨床對照試驗的效果，并對ASVs 表進行加權(quán)處理，進一步減小混雜因素的影響。PSM 法雖然可以校正混雜因素，但是減少了樣本量。物種組成分析中，在門水平上，無論是HLP 組還是對照組，擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門雖然都是優(yōu)勢菌，但是兩組的比例不同，HLP 組中擬桿菌門高于對照組，厚壁菌門、放線菌門低于對照組。在屬水平上，分析了平均相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬，其中HLP 組中的擬桿菌屬、普氏菌屬、毛螺菌屬、Agathobacter、Lachnoclostridium含量高于對照組，糞桿菌屬、雙歧桿菌屬、Subdoligranulum、瘤胃菌屬_UCG-013、Alistipes含量低于對照組。Alpha 和Beta 多樣性分析結(jié)果顯示：兩組無顯著差異，而HLP 組的多樣性略低于對照組。

在HLP 組和非高脂血癥組中，利用QIIME2 ANCOM 共找到 7 個差異 ASV（ASV_232、ASV_63、ASV_173、ASV_46、ASV_393、ASV_283、ASV_41）。其中ASV_232 屬于放線菌門的雙歧桿菌屬，ASV_63、ASV_173 屬于厚壁菌門的糞桿菌屬，ASV_46、ASV_393、ASV_41 屬于擬桿菌門的擬桿菌屬，ASV_283 屬于厚壁菌門的Ruminococcaceae_UCG-013 屬。其中在HLP 組中擬桿菌屬含量高于對照組，而糞桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃菌屬含量要低于對照組。

分別以CHO、TG、HDL-C、LDL-C 為分組指標(biāo)，通過QIIME2 ANCOM 找到差異ASVs。在TG組和非TG 組中，有一個差異ASV（ASV_422），W值為2 167，屬于厚壁菌門的毛螺菌科，未注釋到屬。在HDL-C 組和非HDL-C 組中，共有18 個差異ASVs，其中ASV_9、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_80、ASV_99、ASV_45、ASV_243、ASV_516 均屬于擬桿菌門的擬桿菌屬，ASV_15 屬于厚壁菌門的Agathobacter屬；ASV_56、ASV_636 屬于厚壁菌門的Subdoligranulum屬；ASV_153、ASV_74 分別屬于厚壁菌門的疣微菌科、毛螺菌科，未注釋到屬水平；ASV_109 和ASV_13 均屬于厚壁菌門的毛螺菌科的Lachnoclostridium屬；ASV_96 和ASV_259 均 屬 于 厚 壁 菌 門 的Lachnospiraceae_UCG-010 屬。

雙歧桿菌是已知的與腸道膽汁酸和膽固醇代謝有關(guān)的細(xì)菌屬，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，如抑菌、免疫調(diào)節(jié)等有益作用[20-22]，目前關(guān)于瘤胃菌屬的研究表明，瘤胃菌屬是纖維素分解細(xì)菌，降解纖維素和半纖維素的細(xì)菌。在Chen 等[23]的小鼠研究中，試驗組（發(fā)酵胡蘿卜汁組）的瘤胃菌屬含量高于對照組。瘤胃菌屬_UCG-013 被認(rèn)為是有益的類群[24]，與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生者，其豐度與炎癥和T2DM 呈負(fù)相關(guān)。瘤胃菌屬以其產(chǎn)丁酸鹽的特性而著稱，對膳食纖維和碳水化合物的分解和利用效率較高。丁酸顯著逆轉(zhuǎn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，提高了抗氧化酶（SOD）的水平[23-27]。在Chen 等[28]和Ren 等[29]的研究中，也發(fā)現(xiàn)瘤胃菌屬的變化，瘤胃菌屬_UCG-013 的減少與碳代謝受阻有關(guān)，在調(diào)節(jié)碳水化合物的代謝途徑中起作用，這可能會影響宿主的消化。本研究說明瘤胃菌屬可能在高脂血癥中發(fā)揮重要的作用。糞桿菌屬是抗炎癥相關(guān)菌，Giorgio 等[30]研究表明，血脂參數(shù)的變化與特定細(xì)菌類群的豐富度改變有關(guān)，其中包括瘤胃菌屬、糞桿菌屬。Subdoligranulum是短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，有研究在PE 患者中發(fā)現(xiàn)的腸道菌屬Blautia，Eubacterium_rectale，Eubacterium_hallii，Collinsella和Subdoligranulum的減少主要是產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌，這些患者中丁酸的減少可能是由這些糞便細(xì)菌的缺乏引起的[31-33]。此外，戊酸與GM 的關(guān)系似乎比丁酸更緊密，即：戊酸與更多屬于厚壁菌屬正相關(guān)，而與更多屬于普氏菌屬負(fù)相關(guān)，表明糞便中的戊酸水平可能可以作為轉(zhuǎn)基因營養(yǎng)不良的敏感指標(biāo)[32]。在這兩篇文章中，發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬組成發(fā)生變化[34-35]。Omar 等[36]研究發(fā)現(xiàn)與健康個體相比，胃腫瘤患者的糞便中腸桿菌科水平升高，而直腸腫瘤患者糞便中的雙歧桿菌水平較低；在患有結(jié)腸腫瘤的患者中觀察到較低的乳桿菌科的豐度，在癌癥治療后取樣的GIT 患者的糞便中乳酸桿菌的豐度更高；除了位點特異性差異外，患有腫瘤的患者中都存在高豐度瘤胃球菌及Subdoligranulum菌和低豐度的Lachnoclostridium和Oscillibacter菌。

4 結(jié)論

綜上所述，高脂血癥患者腸道菌群相比非高脂血癥人群出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和豐度變化，通過QIIME2 ANCOM 找到以下差異腸道菌群，毛螺菌科、疣微菌科，雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、擬桿菌屬、瘤胃菌屬_UCG -013、Agathobacter、Subdoligranulum、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-010 屬，功能預(yù)測結(jié)果表明碳水化合物代謝和氨基酸代謝所占比例較大。以期為高脂血癥的預(yù)防和診療提供科學(xué)的參考。