石 娟，李勇勇，周麗萍，李超群，王 晴，婁永江

（寧波大學食品與藥學學院 浙江寧波315211）

中華管鞭蝦（Solenocera melantho）是我國深受歡迎的海捕蝦之一[1]。蝦類因富含蛋白質(zhì)和水分，易腐敗變質(zhì)，故水產(chǎn)品保鮮中常采用冷凍貯藏的方式[2-3]。然而，在長時間的凍藏過程中，冷庫壓縮機頻繁啟、停造成的溫度波動使細胞內(nèi)冰晶不斷長大，發(fā)生反復凍融現(xiàn)象，進而造成品質(zhì)下降，如蛋白質(zhì)變性、汁液流失、持水力下降等[4-6]?？刂撇p少冷庫溫度波動是提高凍藏保鮮效果的前提。

近年來，蛋白質(zhì)組學技術(shù)廣泛應用于水產(chǎn)品，如Terova 等[7]研究了鱸魚肌肉蛋白質(zhì)在不同溫度貯藏過程中的變化，結(jié)果表明：有兩種蛋白可能成為潛在的鮮度標志物。李學鵬[8]和趙巧靈[9]分別研究了冷藏過程中的中國對蝦和金槍魚的品質(zhì)變化規(guī)律，利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選出冷藏過程中與鮮度相關(guān)的指示蛋白。iTRAQ技術(shù)具有通量高、定量準確、分辨率高等優(yōu)點，近年來得到廣泛應用[10]。然而，從iTRAQ技術(shù)角度分析恒溫凍藏過程對中華管鞭蝦肌肉蛋白表達的影響未見系統(tǒng)研究。

通過iTRAQ技術(shù)對篩選得到的差異蛋白進行GO 分析、KEGG 富集分析，并通過Pearson 相關(guān)性分析探討恒溫凍藏和常規(guī)凍藏過程中蝦肌肉品質(zhì)與蛋白質(zhì)變化間的相關(guān)性，旨在從分子水平上揭示蝦肉在不同凍藏條件下品質(zhì)變化機制及預測鮮度指示蛋白，為后續(xù)監(jiān)測中華管鞭蝦的新鮮度提供理論依據(jù)，為其凍藏工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華管鞭蝦購于浙江寧波某水產(chǎn)市場，加冰快速運至實驗室。蓄冷劑由無機鹽類等復配而成。

iTRAQ 標記試劑盒，美國AB SCIEX 公司；BCA 試劑盒、質(zhì)譜級水（H2O）、質(zhì)譜級乙腈（ACN），美國Thermo Scientific 公司；甲酸（FA），德國CNW 公司；胰酶，北京華利世公司；考馬斯亮藍G-250，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive-HF 質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1200 液相系統(tǒng)、Orbitrap Fusion 質(zhì)譜儀，上海Thermo Fisher公司；DYY-6C SDS-PAGE 凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；ST-360 酶標儀，上海科華實驗系統(tǒng)有限公司；COS-03USB 溫濕度記錄儀，山東建大仁科電子科技有限公司；BC/BD-826HSQ 臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜，青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預處理 本研究采用不銹鋼箱體和蓄冷劑組成一個恒溫箱，將此箱置于-25 ℃的臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜中（模擬冷庫），再將中華管鞭蝦置于恒溫箱中（箱內(nèi)，XN）和冰柜中（箱外，XW）凍藏，即恒溫凍藏和常規(guī)凍藏。運用iTRAQ技術(shù)分別分析箱內(nèi)儲存30，60，90 d（XN1、XN2、XN3）和箱外儲存30，60，90 d（XW1、XW2、XW3），中華管鞭蝦肌肉差異蛋白的表達情況【與新鮮組（CK）相比】，即XN1/CK、XN2/CK、XN3/CK、XW1/CK、XW2/CK、XW3/CK 6 個比較組中差異蛋白的表達情況。在-25 ℃環(huán)境下凍藏之前，先用溫度記錄儀連續(xù)48 h 測量箱內(nèi)和箱外溫度變化，恒溫箱如圖1所示，蓄冷劑從1 灌入。將新鮮蝦沖洗、擦拭干凈后，隨機分成6 組，即XN1、XN2、XN3、XW1、XW2、XW3 組，分別置于箱內(nèi)和箱外。凍藏完成后，樣品置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 恒溫箱結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of thermostat

1.3.2 品質(zhì)指標測定 pH 值參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH 值的測定》[11]進行測定。TVB-N 值參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[12]中的半微量定氮法進行測定。通過色差儀測定帶殼中華管鞭蝦第二、三腹節(jié)表面的明亮度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）[4]。取蝦第二、第三腹節(jié)肌肉置于質(zhì)構(gòu)儀上測定其硬度、彈性；探頭為直徑3 mm的圓柱形，測試速度為1 mm/s，測試形變量為50%[4]。

1.3.3 蛋白提取 將研磨好的樣品粉末轉(zhuǎn)移至離心管并加入600 μL 酚抽提取液，加入蛋白酶抑制劑使其終濃度為1.0 mmol/L，超聲3 min。加入酚-Tris-HCl（pH 7.8）飽和溶液（等體積），4 ℃混勻30 min。離心10 min，收集酚上層。加入5 倍體積預冷的0.1 mol/L 醋酸銨-甲醇溶液，-20 ℃過夜沉淀，離心后收集沉淀。向沉淀中加入5 倍體積預冷的甲醇混合用于清洗，離心后收集沉淀。以丙酮代替甲醇，重復以上步驟2 次。干燥后，溶解于樣品裂解液中（3 h）。離心后取上清即為樣品的總蛋白溶液，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 蛋白濃度測定 參考文獻，采用BCA 蛋白濃度測定法測定蛋白質(zhì)濃度[13]。

1.3.5 SDS-PAGE 電泳檢測 取10 μg 蛋白，采用12% SDS-PAGE 分離，分離后的凝膠用考馬斯亮蘭染色法染色[14]。

1.3.6 胰蛋白酶酶解 每個樣品分別取100 μg，并將各組樣品調(diào)整到同濃度、同體積。分別向各組蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT），混勻，使其終濃度為4.5 mmol/L，在55 ℃溫度條件下孵育30 min 后在冰上冷卻至室溫。加入相應體積的碘乙酰胺，混勻，使得其終濃度為9.0 mmol/L，室溫避光條件下放置15 min。分別在各溶液中加入6 倍體積的丙酮，-20 ℃放置不少于4 h。離心10 min 收集沉淀，靜置3 min 使丙酮揮發(fā)。加入100 μL 四乙基溴化銨（Tetraethylammonium bromide，TEAB）復溶沉淀，加入1 mg/mL 胰酶（20 μg），并于37 ℃消化過夜。酶解后凍干樣置于-80℃保存。

1.3.7 肽段除鹽 采用RP-C18 固相萃取柱脫鹽。活化：取600 μL 甲醇溶液，加入到除鹽柱中活化柱子，重復一次；平衡：使用600 μL 80%乙腈-水（ACN-H2O，含0.1%甲酸）沖洗2 次，再用600 μL 0.1%甲酸-水（FA-H2O）沖洗2 次；吸附樣品：樣品上樣，靠重力自然吸附2 次；除鹽：使用600 μL 0.1% FA-H2O 沖洗3 次；洗脫：用600 μL 80% ACN-H2O（含0.1% FA）靠重力自然洗脫2次，洗脫液凍干后于-80 ℃保存。

1.3.8 肽段標記 向樣品中加入66 μL 200 mmol/L TEAB 緩沖液，混勻后取30 μL 標記反應。將平衡至室溫的iTRAQ 試劑離心至管底，加入140 μL 異丙醇，渦流混勻，離心，重復1 次。向樣品中加入75 μL iTRAQ 試劑混勻，室溫條件下放置2 h 后加入200 μL 水以終止反應，放置30 min，凍干后置于-80 ℃保存。

1.3.9 反相色譜分離 將標記好的肽段采用Agilent 1100 HPLC 液相色譜進行分離，收集好樣品后進行冷凍干燥，于-80 ℃保存。

1.3.10 色譜條件與質(zhì)譜條件

1）色譜條件 樣品以300 nL/min 的流速上樣到預柱Acclaim PepMap 100 RP-C18（100 μm×2 cm，美國Thermo Fisher 公司），再經(jīng)分析柱Acclaim Pep Map RSLC RP-C18（75 μm×15 cm，美國Thermo Fisher 公司）分離。流動相A：VH2O∶VFA=99.9∶0.1，流動相B：VCAN∶VH2O∶VFA=80∶19.9∶0.1；梯度洗脫條件：0～1 min，2%～9% B；1～45 min，9%～29% B；45～52 min，29%～37% B；52～56 min，37%～100% B；56～60 min，100% B。

2）質(zhì)譜條件 一級分辨率為60 000，自動增益控制值（AGC）設(shè)為3×106，最大注射時間50 ms；掃描范圍350～1 500m/z，并對其中10 個最高峰進行MS/MS 掃描；MS/MS 的分辨率設(shè)為15 000，AGC 設(shè)為2×105，最大注射時間為40 ms；動態(tài)排除時間設(shè)為30 s。

1.3.11 生物信息學分析 本次使用數(shù)據(jù)庫NCBI-1413-IPG-Decapoda-sequence.fasta，搜庫軟件：Proteome Discover 2.4（美國Thermo fisher 公司）。差異篩選條件：差異倍數(shù)FC＞1.2 且P<0.05。從參與的生物過程、細胞組成和分子功能3 個方面對篩選出的差異蛋白進行GO 分析，通過KEGG 分析差異蛋白參與的信號通路。使用SAS 8.0 進行單因素方差分析及Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 箱內(nèi)、箱外溫度變化趨勢

箱內(nèi)、箱外溫度變化如圖2所示，箱外溫度變化約是箱內(nèi)的10 倍，說明此恒溫箱能較好地控制溫度波動。

圖2 連續(xù)48 h 箱外、箱內(nèi)溫度變化圖Fig.2 Temperature change diagram inside and outside the box for 48 h

2.2 SDS-PAGE 電泳結(jié)果

SDS-PAGE 測定結(jié)果如圖3所示。蛋白條帶清晰，分布均勻，可進行后續(xù)試驗。

圖3 不同處理組中華管鞭蝦的凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Results of gel electrophoresis of Solenocera melantho of different treatment groups

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

本試驗共得到肽段2 284 個，鑒定到的總蛋白組數(shù)為740 個。結(jié)果顯示，在所有鑒定到的蛋白質(zhì)中，有57.03%的蛋白質(zhì)至少含有2 個肽段，大部分鑒定的蛋白質(zhì)含肽段數(shù)在10 個以內(nèi)（圖4a）。圖4b 的餅狀圖百分比表示不同覆蓋度范圍的蛋白數(shù)占總蛋白數(shù)的比例，其中37.70%的蛋白質(zhì)具有超出10%的序列覆蓋度。

圖4 肽段數(shù)量分布圖（a）和肽段序列覆蓋度分布圖（b）Fig.4 Peptide number distribution map（a）and peptide sequence coverage map（b）

2.4 差異蛋白篩選

不同處理組中華管鞭蝦的差異蛋白結(jié)果見表1。6 個比較組中都含有上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白，且隨著凍藏時間延長，差異蛋白數(shù)量增多，表明隨著凍藏時間的延長蝦肉蛋白質(zhì)的變化速率加快。不同條件凍藏90 d 后箱內(nèi)差異蛋白小于箱外差異蛋白數(shù)，表明恒溫過程更有利于蝦的保鮮。箱內(nèi)3 組共篩選出30 個共有差異蛋白（表2），箱外3 組共篩選出18 個共有差異蛋白（表3），共有差異蛋白隨著儲存時間的延長出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化趨勢，這說明了共有差異蛋白發(fā)生的變化和儲存時間有著緊密聯(lián)系。共有蛋白可能成為凍藏過程中與蝦品質(zhì)相關(guān)的鮮度指示蛋白。

表1 不同處理組中華管鞭蝦的差異蛋白結(jié)果Table 1 Differential protein results of Solenocera melantho of different treatment groups

表2 箱內(nèi)3 組共有差異蛋白Table 2 Common differential proteins in the three inside the box

表3 箱外3 組共有差異蛋白Table 3 Common differential proteins in the three outside the box

（續(xù)表2）

2.5 生物信息學分析

2.5.1 GO 功能分析 對箱內(nèi)3 組（圖5）和箱外3組（圖6）差異蛋白進行GO 功能分析發(fā)現(xiàn)，6 組差異蛋白參與的生物過程（Biological process）均主要為細胞過程（Cellular process）、生物學調(diào)控（Biological regulation）；在細胞組分（Cellular component）中均主要參與細胞（Cell）、細胞部分（Cell part）和細胞器（Organelle）；在分子功能（Molecular function）中均主要參與結(jié)合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）及結(jié)構(gòu)分子活性（Structural molecule activity）。

圖5 箱內(nèi)各比較組中差異蛋白的GO 功能注釋圖Fig.5 GO annotation of differential proteins in each comparison group inside the box

圖6 箱外各比較組中差異蛋白的GO 功能注釋圖Fig.6 GO annotation of differential proteins in each comparison group outside the box

2.5.2 KEGG 富集分析 KEGG 是分析蛋白質(zhì)在細胞中的代謝途徑的主要數(shù)據(jù)庫[15]。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，無論箱內(nèi)3 組（圖7）還是箱外3組（圖8）的差異蛋白都主要富集在緊密連接（Tight junction）、心肌細胞的腎上腺素信號傳導（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）和心肌收縮（Cardiac muscle contraction）途徑中，其中緊密連接通路富集最顯著。

圖7 箱內(nèi)各比較組中差異蛋白的KEGG 富集氣泡圖Fig.7 Bubble chart of KEGG enrichment analysis of differential proteins in each comparison group inside the box

圖8 箱外各比較組中差異蛋白的KEGG 富集氣泡圖Fig.8 Bubble chart of KEGG enrichment analysis of differential proteins in each comparison group outside the box

2.6 差異蛋白與新鮮度相關(guān)性分析

凍藏過程中蝦的品質(zhì)會受到多種因素的影響，使用多個指標來評價其新鮮度較為客觀全面，而pH 值、TVB-N 值、色差值（L*、a*、b*值）、質(zhì)構(gòu)是評價其新鮮度的重要指標[16-19]。將共有差異蛋白與新鮮度指標（pH 值、TVB-N 值、L*、a*、b*值、硬度、彈性）進行相關(guān)性分析，可進一步了解差異蛋白與品質(zhì)之間的相關(guān)性，進而探究蝦肉品質(zhì)變化機制[20-21]。中華管鞭蝦在不同凍藏條件下的品質(zhì)變化如表4所示。

表4 中華管鞭蝦在不同凍藏條件下的品質(zhì)變化Table 4 Quality changes of Solenocera melantho under different frozen storage conditions

箱內(nèi)共有蛋白與品質(zhì)指標的相關(guān)性分析結(jié)果表明，有8 個差異蛋白與中華管鞭蝦的pH 值、TVB-N 值、色澤（L*、a*、b*值）、質(zhì)構(gòu)（硬度、彈性）中的其中至少一個指標呈顯著相關(guān)（表5）。除了假設(shè)蛋白PF00833.14（JAI67045.1）、假設(shè)烏頭酸水合酶（ROT85673.1）外，共篩選出6 個蛋白，分別是肌球蛋白重鏈（XP_027227239.1）、肌動蛋白（XP_027223047.1）、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（I2DDG2.1）、T 復合蛋白1 亞基β 樣亞型X1（XP_027231689.1）、NDUFA13（AIY53011.1）、酪氨酸脫羧酶2（ROT63152.1）。肌球蛋白是與肌動蛋白相連的動力蛋白，在維持細胞形狀、調(diào)控肌肉收縮、細胞移動、能量代謝等方面起著重要作用[22-24]。肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC）是肌球蛋白組成的一部分，具有ATP 酶活性，且能與肌動蛋白結(jié)合[25-26]。中華管鞭蝦在凍藏過程中MHC 出現(xiàn)下調(diào)，是因為肌球蛋白會隨著時間的延長不斷降解，這與Shi 等[24]和馬聰聰?shù)萚27]的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明其與蝦a*值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），說明MHC 的下調(diào)會影響蝦肉品質(zhì)。肌動蛋白隨著貯藏時間的延長出現(xiàn)下調(diào)，相關(guān)性分析表明其與蝦pH 值、b*值和硬度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與L*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這說明肌動蛋白的含量也會影響蝦肉的pH 值、色澤及質(zhì)構(gòu)特性。研究表明，肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）一般在無脊椎動物肌肉收縮中參與反應[28-29]。在凍藏過程SCP 先表達上調(diào)，到凍藏后期表達下調(diào)，可能是由于初期蝦死后僵直，參與肌肉收縮反應，為維持細胞骨架而表達上調(diào)，后期僵直解除后SCP 降解而表達下調(diào)。相關(guān)性分析結(jié)果表明SCP 與蝦pH 值、TVB-N 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），b*值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與L*值、硬度、彈性呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），說明SCP 會影響蝦肉品質(zhì)。T 復合蛋白1 亞基β樣亞型X1 與蝦pH 值、b*值呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與L*值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與TVB-N值、硬度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），且其在3 組中均表達下調(diào)，說明此蛋白也會影響蝦肉品質(zhì)。研究表明，NDUFA13 的下調(diào)和抗細胞凋亡之間有一定關(guān)系[30]。相關(guān)性分析表明NDUFA13 與蝦a*值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）且在3 組中均表達下調(diào)，可能是和恒溫凍藏過程中NDUFA13 抵抗細胞凋亡有關(guān)。L-氨基酸是生物體內(nèi)氮代謝的重要初級化合物，氨基酸脫羧酶可以將其進一步代謝生成各種具有不同功能的生物胺，由此溝通了生物體初級代謝和次級代謝，而酪氨酸脫羧酶（Tyrosine decarboxylase，TD）僅對L-酪氨酸、L-多巴和L-苯丙氨酸等極少數(shù)底物具有活力不等的活性[31]。酪氨酸脫羧酶2（TD2）與L*值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），說明TD2 會影響蝦肉的亮度。

表5 箱內(nèi)3 組差異蛋白與品質(zhì)指標的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of the three groups of differential proteins and quality indicators inside the box

箱外共有蛋白與品質(zhì)指標的相關(guān)性分析顯示，有7 個差異蛋白與中華管鞭蝦的pH 值、TVBN 值、色澤（L*、a*、b*值）、質(zhì)構(gòu)（硬度、彈性）中的至少一個指標呈顯著相關(guān)（表6）。除了假設(shè)蛋白PF00833.14（JAI67045.1）、假設(shè)蛋白PF00307.27（JAI64922.1）外，共篩選出5 個蛋白，分別是MHC（XP_027217744.1）、MHC（MPC23537.1）、MHC（XP_027227239.1）、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白β 鏈（P02635.1）、SCP（I2DDG2.1）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，MHC（XP_027217744.1）與蝦TVB-N 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與彈性呈極顯著負相關(guān)（P＜0.05），MHC（MPC23537.1）與蝦b*值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），MHC（XP_027227239.1）與蝦彈性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與恒溫凍藏組不同，MHC 在凍藏過程中先表達上調(diào)后表達下調(diào)，可能是隨著凍藏時間的延長加上受溫度波動的影響導致其表達與恒溫凍藏組不同。肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白β 鏈與蝦TVB-N 值、a*值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）與彈性呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），且在凍藏過程中先表達下調(diào)后表達上調(diào)，可能是由于后期完整蛋白質(zhì)的降解而表達上調(diào)，從而影響蝦肉品質(zhì)。SCP 與蝦pH 值、TVB-N 值、a*值和硬度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）與L*值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），且蛋白表達和恒溫凍藏一致。

表6 箱外3 組差異蛋白與品質(zhì)指標的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of three groups of differential proteins and quality indicators outside the box

恒溫凍藏和常規(guī)凍藏共有的差異蛋白為肌球蛋白重鏈和肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白，這2 個蛋白可能成為與凍藏中華管鞭蝦品質(zhì)變化的蛋白指示物，且從兩者的差異蛋白在凍藏過程中的變化和各項鮮度指標可得恒溫凍藏的保鮮效果優(yōu)于常規(guī)凍藏。

3 結(jié)論

本研究篩選出恒溫凍藏和常規(guī)凍藏的差異蛋白均主要分布在細胞、細胞部分和細胞器中；分子功能分類中主要分布在結(jié)合、催化活性及結(jié)構(gòu)分子活性；篩選出肌球蛋白重鏈和肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白與中華管鞭蝦的pH 值、TVB-N 值、L*、a*、b*值其中至少一個指標呈顯著相關(guān)；恒溫凍藏保鮮效果優(yōu)于常規(guī)凍藏。本研究從iTRAQ技術(shù)角度揭示了中華管鞭蝦在凍藏過程中的品質(zhì)變化機理，同時此恒溫箱放大即可以當作冷庫，為企業(yè)冷庫的改良提供了參考。