雷燕妮，張小斌，楊 梅，陳書存，陳冬平，李多偉,6

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000；3.商洛學(xué)院 健康管理學(xué)院, 陜西 商洛 726000；4.西安宇沐生物技術(shù)研究院有限公司，陜西 西安 710068；5.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000；6.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

蛹蟲草是一種大型藥食用真菌，其體內(nèi)所含的蟲草素經(jīng)過(guò)科學(xué)的檢查和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，能夠有效的抑制細(xì)菌的滋生，并且還能抵抗病毒，遏制腫瘤生長(zhǎng)[1～3]，降低高血糖患者體內(nèi)的血糖含量，醫(yī)學(xué)作用十分巨大[4]；而其所含的蟲草多糖同樣也具很強(qiáng)的保健功效和醫(yī)藥價(jià)值，比如說(shuō)皮膚抗皺、延緩機(jī)體衰老、提高免疫力及增加抗癌能力，對(duì)于患有癌癥的病人也有一定的遏制病情發(fā)展的能力。蛹蟲草人工栽培過(guò)程中有大量廢棄的菌糠產(chǎn)生，目前，食用菌菌糠主要用于加工飼料或生產(chǎn)有機(jī)肥料。而且經(jīng)過(guò)研究和分析得到，即使無(wú)法作為藥品使用的廢棄菌糠內(nèi)也會(huì)還有一定量的蟲草素和蟲草多糖，除此之外還有大量的具有價(jià)值的物質(zhì)[5]，如蛋白質(zhì)、脂肪酸等等。蛹蟲草菌糠有別于其他食用菌菌糠，在蛹蟲草栽培中完全采用食品如大米、小麥和蠶蛹粉等，無(wú)其他抗菌、殺菌的化學(xué)添加劑成分，因此，蛹蟲草菌糠在食品、飲品中應(yīng)用將會(huì)具有很好的經(jīng)濟(jì)效益[6]。

目前，市場(chǎng)上流通的受到很多消費(fèi)者喜愛的保健品一般原料都是酵素，酵素是將水果或蔬菜在有益菌的幫助下進(jìn)行發(fā)酵，而完成發(fā)酵后的產(chǎn)物將會(huì)具有多種對(duì)人體有益的微生物，即人們所說(shuō)的酵素。關(guān)于酵素的作用，除了最常見的延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抑制細(xì)菌滋生、凈血等保健功效外，還有消炎、抗癌等醫(yī)學(xué)功效，因此其十分受消費(fèi)者的喜愛[7，8]。不過(guò)，對(duì)于將菌糠制作成為飲料這一方式，并沒有豐富的研究資料可供參考，也沒有專業(yè)的研究所對(duì)其進(jìn)行充分的實(shí)驗(yàn)。筆者研究為能夠?qū)崿F(xiàn)酵素飲料的大面積生產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值，開辟出新的菌糠利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與設(shè)備

1.1.1 材料 蛹蟲草菌糠：由徐州鴻宇農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；果膠酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司,MRS固體培養(yǎng)基,MRS液體培養(yǎng)基,安琪高活性果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌:陜西省微生物所提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備 植物粉碎機(jī)(FZ102)；冰箱(BCD-245/H)；高壓蒸汽滅菌鍋(SX-280A、上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ)；超聲清洗器(KQ-50DB)；磁力加熱攪拌器(DF-10IS)；恒溫振蕩器(THZ-92A、上海博迅公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV-1700)；電子分析天平(SPS202F)；電熱鼓風(fēng)干燥箱( DHG-9070A)及電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052A)均采購(gòu)自上海鴻都電子科技有限公司；高速離心機(jī)(LD5-10、北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；蒸餾水器(DE-10、上海悅豐)；手動(dòng)單道可調(diào)式移液器(PotPette 100-1000μl、上海大龍醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.2 操作要點(diǎn) 主要有:

(1)蛹蟲草菌糠肽液的制備。選取無(wú)污染的蛹蟲草菌糠粉碎成粗粉，按料液比1∶10、1∶8煮提，煮提時(shí)間120 min、90 min，煮提液過(guò)濾，用20%鹽酸溶液或20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)煮提液pH至 6.5左右，按體積比加入1‰中溫型α-淀粉酶,于60～70℃水解2 h，除去煮提液中的淀粉(產(chǎn)品中過(guò)多淀粉的存在會(huì)嚴(yán)重影響酵素減肥的功效)，在用20%鹽酸溶液或20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)淀粉酶水解液pH至7.5左右，按體積比加入1‰植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，35～45℃酶解3 h，使淀粉酶水解液中蟲草蛋白水解為蟲草蛋白肽，制成蛹蟲草菌糠肽液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)發(fā)酵液的接種和發(fā)酵。取蛹蟲草菌糠肽液200 mL于500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，待滅菌液溫度降至30℃以下時(shí)接入3%～5%的乳酸菌菌液，有氧發(fā)酵30～36 h，在接入0.10%～0.15%的酵母菌菌液繼續(xù)發(fā)酵24～36 h。通過(guò)不同的參數(shù)組合得出在不同接種量、發(fā)酵問題、發(fā)酵時(shí)間等條件下，乳酸菌和酵母菌數(shù)量的變化，以及常規(guī)pH、SOD酶的活性、產(chǎn)物酸度數(shù)值等參數(shù)的變化。

(3)蛹蟲草菌糠肽酵素飲料的制備 上述工藝制得的蛹蟲草菌糠肽酵素液，用檸檬酸和甜菊糖調(diào)配酵素液口感。通過(guò)加入含量的不同從而得到口感和氣味不同的產(chǎn)品，并利用全因子實(shí)驗(yàn)獲得具體的加入量，再以感官評(píng)定確定某一組的測(cè)試者評(píng)分。

1.2.3 測(cè)定方法 主要有:

(1)酵素液中酵母菌含量的測(cè)定,按照GB 4789.15-2016 操作。

(2)酵素液中乳酸菌含量的測(cè)定,按照GB 4789.35-2016操作。

(3)酵素液中S0D活性的測(cè)定,按照GB/T 5009.171-2003操作。

(4)酵素液中酸度的測(cè)定方法, 按照GB/T 12456-2008操作。

(5)酵素液中pH的測(cè)定方法,按照GB/T 12456-2008操作。

2 結(jié)果與討論2.1 酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素對(duì)發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探討各工藝條件相互交叉對(duì)發(fā)酵的影響，我們以SOD活性為指標(biāo),選擇酵母菌接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)3個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,按正交試驗(yàn)L9(33)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 通過(guò)正交試驗(yàn)考察酵母菌發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)因素水平表和結(jié)果分析表見表1。

表1 正交L9(33)及結(jié)果分析

表1極差分析可以看出，B>A>C為各因素對(duì)SOD活性影響的順序。對(duì)于酵母菌來(lái)說(shuō)，發(fā)酵溫度最為重要，其次是菌的接種量和發(fā)酵時(shí)間。根據(jù)全部實(shí)驗(yàn)中得出的最佳組合A3B3C2即接入0.15%的酵母菌后，在30℃的條件下發(fā)酵15 h，即可得到最佳的酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物。

2.2 乳酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素對(duì)發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探討各工藝條件相互交叉對(duì)發(fā)酵的影響，我們以酸度為指標(biāo),選擇乳酸菌接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)3個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,并按照實(shí)驗(yàn)表安排數(shù)值進(jìn)行正交試驗(yàn)，以此來(lái)確定最佳的乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)。具體數(shù)值安排和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表：

表2極差分析可以看出，A>C>B為各因素對(duì)酸度影響的順序。對(duì)于乳酸菌來(lái)說(shuō)，接種量的影響相對(duì)于兩者是最主要的，而發(fā)酵的溫度改變并不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。根據(jù)最優(yōu)全部實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的最優(yōu)組合為A3B1C2即接入6%的乳酸菌后在30℃的條件下發(fā)酵35 h，就可以得到最優(yōu)的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物了。

表2 正交L9(33)及結(jié)果分析

2.3 復(fù)合菌發(fā)酵結(jié)果

在利用蛹蟲草菌糠肽液進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程中，使用了多種發(fā)酵菌，因此要根據(jù)不同菌種的營(yíng)養(yǎng)吸收速率安排出不同的發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵條件，從得到的多個(gè)實(shí)驗(yàn)組中挑選出最佳的一組?？偘l(fā)酵時(shí)間定為40 h，發(fā)酵條件為充分溶氧、為菌種選擇最合適的溫度、最佳pH的條件下，分別先后接入乳酸菌和酵母菌進(jìn)行發(fā)酵研究其不同接種時(shí)間對(duì)乳酸菌和酵母菌數(shù)量的變化以及常規(guī)PH、SOD酶的活性、產(chǎn)物酸度數(shù)值等參數(shù)的變化的影響，具體的試驗(yàn)因素及結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

表3可以看出，SOD活性高的為試驗(yàn)2號(hào)和3號(hào)，試驗(yàn)2號(hào)SOD活性已達(dá)到452.05 U·g-1，為最高值;試驗(yàn)1～4號(hào)以達(dá)到工廠生產(chǎn)要求即酸度都達(dá)到0.50%以上，試驗(yàn)1號(hào)已達(dá)到0.58%，為最高值。

2.4 蛹蟲草肽酵素飲料調(diào)配結(jié)果

取發(fā)酵蛹蟲草菌糠肽液適當(dāng)稀釋，按適當(dāng)比列加入甜菊糖、檸檬酸進(jìn)行飲料的口感調(diào)配。根據(jù)評(píng)分方法(表4)進(jìn)行效果評(píng)價(jià)，之后將加入的因素水平表和結(jié)果總結(jié)至表5。

表4 蛹蟲草肽酵素飲料的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表5 蛹蟲草肽酵素飲料調(diào)配全因子試驗(yàn)結(jié)果

從蛹蟲草肽酵素飲料調(diào)配全因子試驗(yàn)結(jié)果可得到，當(dāng)添加量為0.1%的甜菊糖，0.3%檸檬酸時(shí)，所獲得的評(píng)分是全部實(shí)驗(yàn)中最高的。

表5感官評(píng)定可以看出，實(shí)驗(yàn)號(hào)2味道合適，但氣味并不十分明顯；實(shí)驗(yàn)號(hào)4則氣味和味道都是不特別的突出；實(shí)驗(yàn)號(hào)3經(jīng)過(guò)測(cè)試者品嘗使用后，發(fā)現(xiàn)不僅味道可口，而且香氣撲鼻；試驗(yàn)5～8號(hào)蛹蟲草肽酵素飲料風(fēng)味太濃郁。所以說(shuō)，制作成實(shí)驗(yàn)號(hào)3的方式是最合適的生產(chǎn)方式，不僅口味獨(dú)特，而且伴有濃郁的蛹蟲草香味，經(jīng)酸糖調(diào)配獲得風(fēng)味適宜并伴有濃郁蟲草香味的酵素飲料。

2.5 產(chǎn)品指標(biāo)

2.5.1 感官指標(biāo) 氣味：具有明顯的蟲草味和發(fā)酵氣味；色澤：以金黃色為最佳；口感：無(wú)異味且酸甜度合適，口感綿柔順滑；質(zhì)地：無(wú)雜質(zhì)、沉淀、分層情況的出現(xiàn)，應(yīng)是澄清的金黃色液體。

2.5.2 理化指標(biāo) 總酸>0.35%；pH 3.0～4.0；可溶性固形物≤10%。

2.5.3 微生物指標(biāo) 乳酸菌活菌數(shù)≧12.8×109CFU·mL-1；細(xì)菌總數(shù)(個(gè)·mL-1)≤100；大腸桿菌(個(gè)·L-1)≤3；致病菌未檢出。

3 結(jié)論

根據(jù)以上的分析可知，由于菌類其本身具有不同的特性，所以說(shuō)如何滿足其發(fā)酵條件以及安排發(fā)酵時(shí)間是最主要的調(diào)配酵素飲料的技術(shù)難關(guān)，而筆者研究經(jīng)過(guò)試驗(yàn)測(cè)得的最佳發(fā)酵安排：第一步是在30℃的條件下，加入6%的植物乳桿菌發(fā)酵30 h，第二步在第一步的乳酸菌發(fā)酵完成后再加入0.15%的酵母菌發(fā)酵10 h，溫度仍為30℃保持不變。

蛹蟲草肽酵素飲料調(diào)配最佳配比為用0.1%的甜菊糖和0.3%的檸檬酸對(duì)蛹蟲草肽酵素進(jìn)行調(diào)配，可獲得風(fēng)味適宜，酸甜可口、且伴有濃郁的蟲草香味的蛹蟲草肽酵素飲料。