潘紅梅，臧勝芹，張 亮，張鳳鳴，李興桂，周光斌*

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130；3.綏江縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南綏江 657700）

在卵母細胞體內外發(fā)育過程中，母體老化、飼料中某些毒副因素、培養(yǎng)條件及玻璃化冷凍等均會引起活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）過量累積，造成氧化應激，導致卵母細胞減數(shù)分裂異常、基因表達紊亂以及凋亡等現(xiàn)象[1-2]，從而降低卵母細胞的發(fā)育潛力。因此，減少氧化應激損傷是促進卵母細胞發(fā)育成熟的關鍵。褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙酰基-5-甲氧基色氨，是由哺乳動物松果體中合成分泌的一種吲哚類激素，屬于色氨酸的衍生物，能夠降低卵母細胞內的ROS 水平[3]，緩解上述情況發(fā)生，促進綿羊、豬、牛、水牛、小鼠和人類卵母細胞和胚胎的發(fā)育[4-9]。本文從褪黑素對卵母細胞成熟的影響及其機制等方面加以綜述，以期為褪黑素在家畜生殖調控中的應用提供參考。

1 褪黑素概述

褪黑素最早是由Lerner 等[10]在牛的松果體中分離得到的一類吲哚胺物質，其合成和分泌受光周期調節(jié)。光周期信息經(jīng)哺乳動物視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞接收，通過多突觸神經(jīng)通路傳遞至松果體，調節(jié)褪黑素分泌，影響晝夜節(jié)律和睡眠，甚至調控哺乳動物的季節(jié)性繁殖[11]。褪黑素也是一種強大的抗氧化劑和抗凋亡劑，具有直接清除自由基、調節(jié)抗氧化酶（如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶）的基因表達、減少活性氧和活性氮產(chǎn)生，防止細胞氧化損傷，保護細胞中的大分子物質等能力[12]。

褪黑素膜受體MTI 和MT2 均屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族，兩者具有不同的分子結構、分子生物學特性和染色體位置[13]。褪黑素可通過膜受體、核受體視黃酸相關孤兒核受體（RORs）以及與細胞質分子的相互作用影響細胞生理[14]，影響p21和5-LOX等在細胞增殖中具有重要功能基因的轉錄[15]。

2 外源性褪黑素對哺乳動物卵母細胞的影響

2.1 外源性褪黑素有利于體內卵母細胞發(fā)育 體內正常發(fā)育過程中，卵母細胞處于低氧環(huán)境，卵泡液中含有的自由基清除劑和抗氧化酶可保護卵母細胞免受氧化損傷[16]。褪黑素作為抗氧化物質之一，能直接清除ROS 與自由基[17]；也可通過增加抗氧化酶和谷胱甘肽（GSH）的表達水平與活性來抑制促氧化酶從而減少細胞氧化損傷[18]?；诖?，外源性添加褪黑素能改善非正常狀態(tài)下母體（疾病、老齡）的繁殖力。其中，口服褪黑素可抑制過量ROS 產(chǎn)生，保護正常卵泡發(fā)育，治療人卵巢早衰[19]。而在不同孕期小鼠飲水中添加褪黑素，早孕小鼠的胚胎著床、孕前黃體發(fā)育和子宮容受性都有所提高，這可能與褪黑素上調了參與卵巢孕烯醇酮合成和子宮內膜表達的基因有關[20]。外源性褪黑素對不同動物體內卵母細胞發(fā)育的影響見表1。

表1 外源性褪黑素對不同動物體內卵母細胞發(fā)育的影響

隨著年齡增長，卵母細胞質量下降，高度老年化母體的卵母細胞減數(shù)分裂過程中非整倍體增多與卵泡液中褪黑素豐度的降低高度相關[21]。老齡小鼠卵母細胞暴露于外源性褪黑素不僅可以減少ROS 誘導的DNA 損傷和凋亡，還可以抑制由紡錘體/染色體缺陷引起的非整倍體的發(fā)生[22]。卵巢內卵母細胞數(shù)量和質量逐漸降低的過程被認為是哺乳動物生殖衰老的過程。有研究采用自然衰老小鼠模型，探討褪黑素對卵母細胞質量影響的可能機制，數(shù)據(jù)表明，外源補充褪黑素能夠顯著降低老年小鼠卵母細胞減數(shù)分裂缺陷的發(fā)生率[23]。

2.2 外源性褪黑素可促進卵母細胞的體外成熟 體外培養(yǎng)過程中，卵母細胞對溫度、滲透壓、氧氣、營養(yǎng)限制、pH 和毒素等[26]外源因素的變化高度敏感，易產(chǎn)生大量ROS，引起細胞DNA 損傷、線粒體功能紊亂、早期凋亡等，進而影響卵母細胞的成熟。褪黑素作為一種強有力的抗氧化劑和自由基清除劑，能顯著降低細胞內ROS 水平，清除自由基，促進卵母細胞的體外成熟。

2.2.1 褪黑素可降低卵母細胞氧化應激水平 體外成熟（IVM）卵母細胞處于一個相對高氧的環(huán)境，缺乏自由基清除劑和抗氧化酶保護，容易產(chǎn)生過量ROS，從而表現(xiàn)出較低的質量和發(fā)育潛力。褪黑素能夠有效緩解氧化應激，顯著降低早期凋亡水平，提高卵丘卵母細胞復合物（COCs）的發(fā)育，提高卵母細胞核成熟，顆粒細胞擴張、有助于受精、卵裂及囊胚的形成和發(fā)育。研究表明，體外成熟培養(yǎng)液中添加 10-9mol/L 褪黑素可有效緩解牛卵母細胞氧化應激，提高卵母細胞成熟率，保護其紡錘體與線粒體完整性，改善其表觀修飾，從而提高卵母細胞質量和發(fā)育潛力，并顯著促進后續(xù)克隆胚胎和體外受精胚胎的發(fā)育[16]。褪黑素可提高豬腔前卵泡卵母細胞-顆粒細胞復合體的發(fā)育能力[6]。添加10-7mol/L褪黑素可通過促進網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用，促進人卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育[27]。在山羊幼年卵母細胞體外成熟過程中，添加褪黑素可降低ROS 水平和提高線粒體活性，提高幼年山羊卵母細胞的發(fā)育能力[28]。

2.2.2 褪黑素能夠改善卵母細胞線粒體功能 線粒體合成的ATP 是卵母細胞發(fā)育所需能量的重要來源[29]。高氧環(huán)境下，線粒體基因組 (mtDNA) 由于無核膜包被、無組蛋白保護等極易受到自由基攻擊而損傷[30]。當線粒體功能受損時，除通過線粒體自身的堿基切除修復、錯配修復等機制減少損傷外，外源補充褪黑素可改善卵母細胞質量，提升卵母細胞發(fā)育潛力。褪黑素可通過有效抑制IVM 培養(yǎng)過程中的環(huán)境應激，降低細胞內過量的Ca2+水平[31]，維持卵母細胞線粒體氧化磷酸化功能，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供充足ATP[32]。GV 期卵母細胞玻璃化冷凍會使線粒體膜電位和ATP 含量下降，異常紡錘體增加，而添加褪黑素可顯著緩解上述現(xiàn)象[33]。類似地，褪黑素也可改善綿羊卵母細胞線粒體功能，促進其恢復減數(shù)分裂[34]。綜上，褪黑素可優(yōu)化線粒體功能，在IVM 期間保持卵母細胞線粒體膜電位，增加ATP 含量，促進卵母細胞的發(fā)育。

2.2.3 褪黑素能夠保護卵母細胞免受某些環(huán)境毒素的損害 隨著污染越來越嚴重，環(huán)境中某些有毒物質對卵母細胞會產(chǎn)生毒副作用。研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂成熟過程中，小鼠卵母細胞暴露在苯并芘（B[ghi]P）中會引起卵母細胞質量下降，加入褪黑素后能緩解該現(xiàn)象[35]。褪黑素對雙酚A（BPA）誘導的小鼠卵母細胞質量惡化有挽救作用[36]。此外，動物采食的飼料中也可能會含有一些毒副物質。如滅草凈（Fenoxaprop-ethyl，F(xiàn)E）可破壞卵母細胞骨架的完整性和誘導過量ROS 積累而導致卵母細胞減數(shù)分裂異常，而褪黑素可緩解滅草凈導致的缺陷[37]。褪黑素還可以抑制卵丘細胞中黃曲霉毒素B1（AFB1）的代謝[38]。有研究報道了赭曲霉素（OTA）對豬卵母細胞質量的毒性以及褪黑素對OTA 暴露的卵母細胞具有保護作用[39]。MEHP 是增塑劑（DHEP）在體內的活性代謝物，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對MEHP 誘導的豬卵母細胞減數(shù)分裂缺陷有明顯的改善作用[40]。

3 褪黑素對卵母細胞體外成熟后繼續(xù)發(fā)育的影響

目前，豬、牛、羊等家畜的體外胚胎囊胚發(fā)育率分別 為17.9%[41]、37.1%～52.8%[42]、34%～43.4%[43]，很 大程度上限制了體外胚胎的生產(chǎn)效率，因此改善體外成熟卵母細胞的發(fā)育效率至關重要。哺乳動物卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的褪黑素有利于調節(jié)細胞器正常分布，增加GSH 和 ATP 含量，提高抗氧化基因表達水平，進而促進卵母細胞受精和發(fā)育能力[44]。褪黑素處理山羊幼年卵母細胞，受精后第8 天檢測發(fā)現(xiàn)細胞內ROS 水平顯著低于對照組，線粒體活性和ATP 含量均有所提高，囊胚質量得到改善[28]。生理濃度（10-9mol/L）的褪黑素不僅能促進豬卵母細胞的成熟率，也會增加孤雌胚泡的囊胚率和細胞數(shù)量[45]。當培養(yǎng)液中褪黑素的添加濃度過高（如10-3mol/L）時，可能對著床前胚胎有一定的毒性作用，胚胎體外孵化率僅為15%，顯著低于10-9mol/L 添加組[9]。不同物種卵母細胞或胚胎體外發(fā)育過程中添加適宜褪黑素濃度詳見表2。

表2 不同物種卵母細胞體外發(fā)育過程中添加適宜外源性褪黑素濃度范圍

4 褪黑素促進卵母細胞體外成熟的潛在機制

褪黑素以膜受體依賴或非依賴方式保護卵母細胞，降低氧化應激損傷，促進卵母細胞體外成熟。

4.1 膜受體依賴方式 研究表明，牛卵母細胞和卵丘細胞細胞膜上均檢測到褪黑素受體（MTl 和MT2）的表達[46]，而有研究顯示，牛卵母細胞的細胞膜上兩類受體均表達，但卵丘細胞的細胞膜上只有MT2 受體[47]。盡管如此，當卵母細胞成熟液中添加褪黑素受體激動劑或拮抗劑時，受體激動劑改善牛卵母細胞體外成熟，拮抗劑抑制牛卵母細胞成熟，表明褪黑素的確可通過其受體信號通路作用促進牛卵母細胞體外成熟[46]。類似的研究也顯示，豬的卵丘細胞和顆粒細胞中有褪黑素受體mRNA 表達，褪黑素可能通過受體介導直接對卵母細胞成熟起作用[48]。

褪黑素受體可通過G 蛋白偶聯(lián)受體介導的信號抑制cAMP 信號轉導級聯(lián)反應，調節(jié)細胞活動。MT1 激活可下調細胞內激活蛋白激酶A（PKA）活性，抑制AC/ cAMP/PKA/cAMP反應元件結合蛋白（CREB）通路，進而降低cAMP 的生成，刺激鉀離子通道和細胞內信號傳導；活化的MT1 還可誘導一過性的胞質鈣離子與磷酸肌醇濃度升高[49]。而MT2 受體激活蛋白激酶C（PKC），誘導細胞內Ca2+釋放。褪黑素通過膜受體介導機制上調卵母細胞成熟相關基因GDF9和MARF1、表觀遺傳修飾基因DNMT1a、卵丘擴張基因PTX3和HAS1/2的表達水平，進而促進卵母細胞的成熟[46]。此外，褪黑素也能與核受體RZR/RORa結合，進而引起 RZR 調控元件結合p21和5-脂氧合酶等基因的啟動子，從而調控轉錄[50]。

4.2 非受體依賴方式 單細胞RNA 測序發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可通過上調線粒體氧化磷酸化通路中與ATP 生成相關COX17、ATP6V1G2等6 個基因，有效抑制人卵母細胞IVM 培養(yǎng)期間的環(huán)境應激，較好地維持線粒體氧化磷酸化功能和ROS 生成與抗氧化能力之間的平衡，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供足夠ATP[32]。Bcl-2（抗凋亡基因）或Bax（促凋亡基因）表達量的高低對細胞是生存或死亡起決定作用。在綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基中添加褪黑素，可上調Bcl-2 和下調Bax 的表達，促進卵母細胞體外成熟以及其孤雌激活后的胚胎發(fā)育[51]。

褪黑素對AKT 抑制有顯著的保護作用[5]。添加褪黑素顯著阻止了AKT 抑制劑在卵母細胞成熟過程的抗發(fā)育作用，最終改善了核成熟、卵丘細胞擴張、早期卵裂，和第8 天囊胚的發(fā)育速度。對AKT 基因水平和蛋白水平的檢測結果顯示，褪黑素和AKT 信號通路之間存在互作效應，有利于卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育[5]。

外源性褪黑素還可通過Sirt1/Sod2依賴機制逆轉老化卵母細胞的表型缺陷，使卵母細胞Sirt1 及Sod 的蛋白表達水平上升，降低ROS 水平和DNA 損傷，使PGC1-α的蛋白表達水平上升，進而使ATP5a1等基因的表達水平上升，增加線粒體拷貝數(shù)，提升線粒體功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過SIRT1-MnSOD依賴的途徑延緩小鼠排卵后卵母細胞老化，為褪黑素在輔助生殖技術領域的進一步應用提供分子機制支持[52]。褪黑素也可誘導衰老小鼠卵母細胞中Sirt2的表達，降低H4K16 的乙酰化水平，進而促進微絲微管連接的建立和減少減數(shù)分裂的缺陷[53]。

哺乳動物的卵母細胞在MI 前期停留的時間較長，容易造成DNA 損傷的積累。積累的DNA 損傷會增加卵母細胞中染色體斷裂、紡錘體異常、線粒體聚集和氧化應激，進而導致卵母細胞質量惡化。褪黑素也可通過加強非同源末端連接（NHEJ）促進DNA 修復，保護卵母細胞在早期停滯期間免受DNA 損傷，同時防止卵母細胞在減數(shù)分裂成熟過程中質量的惡化，改善小鼠卵母細胞質量[54]。最近，研究者在小鼠視網(wǎng)膜上又發(fā)現(xiàn)了組織特異性應答褪黑素的新機制[55]。由此可見，褪黑素對哺乳動物機體，以至哺乳動物卵母細胞的作用機制是多方面的，還需繼續(xù)展開深入的研究。

5 小結與展望

綜上所述，不同物種卵母細胞在體內外成熟過程中，補充適宜濃度的外源性褪黑素可保護卵母細胞免受氧化損傷或某些毒素的損害，主要通過降低氧化應激水平，減少DNA 的損傷、抑制早期凋亡、維持線粒體功能、改善紡錘體形態(tài)和恢復微絲微管肌動蛋白的活力及降低卵母細胞非整倍體的產(chǎn)生幾率，從而提高卵母細胞的成熟比例和質量，進而提高精子與卵母細胞的結合能力，促進早期胚胎的發(fā)育潛力。褪黑素對哺乳動物卵母細胞的保護作用機制復雜多樣，它們可通過多種通路互作，協(xié)同作用，而具體是如何協(xié)同互作發(fā)揮有益調節(jié)作用的，還需要廣大研究人員不斷探索。