王俊博，高 峰，韓文昌，曹榮峰，付開強(qiáng)

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是導(dǎo)致奶牛不孕的主要原因之一[1]，其病因主要是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌感染[2]。臨床上多采用子宮灌注抗生素來治療奶牛子宮內(nèi)膜炎[3]，但抗生素治療易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性且造成牛奶中抗生素殘留，因此“減抗和替抗”、中藥治療成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。本課題組前期用革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖（LPS）成功構(gòu)建了奶牛子宮內(nèi)膜炎細(xì)胞模型[4]，并對系列中藥單體的抗炎作用進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)多種中藥成分均能抑制炎性反應(yīng)，抗子宮內(nèi)膜炎復(fù)方中藥中一般都含天然三萜羧酸化合物——熊果酸（UA），UA 廣泛分布于7個(gè)科46 個(gè)屬的62 種植物中，其參與植物的防御作用，對動(dòng)物有抗氧化、抗炎和抗癌等作用，是我國批準(zhǔn)的二類新藥[5-6]。UA 具有抗炎、抗氧化等生物活性[7]，能通過調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB 信號通路來抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟炎癥[5]。而UA 對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在體外細(xì)胞模型中UA 對炎性細(xì)胞因子和NF-κB 信號通路活化情況，研究該藥對奶牛子宮內(nèi)膜炎的抗炎作用及其調(diào)控信號通路，為挖掘熊果酸的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，也為篩選抗奶牛子宮內(nèi)膜炎的中藥成分提供方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑和儀器 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（GD-C0507，上海冠導(dǎo)生物工程有限公司）；熊果酸（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；脂多糖（O111：B4，美國Sigma-Aldrich 公司）；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit 試 劑 盒、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 試劑盒、BCA 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；CCK8 試劑盒（北京比奧生物科技有限公司）；Phospho-NF-κB P65、NF-κB P65、Phospho-IκBα（bs-0982R、bs-0465R、bs-18129R，北京奧博森生物技術(shù)有限公司）；IκBα（10268-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-actin（ab8227，英國Abcam 公司）；二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP（bs-0295G，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（RT-6000 型，美國Rayto 公司）等。

1.2 CCK8 比色法測定細(xì)胞活力 BEECs 用含10%胎牛血清的EMEM，5%二氧化碳37℃培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代。將細(xì)胞接種于96 孔板中，1×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h，加0、1、5、10、20、50 和100 μmol/L UA 100 μL 處 理3 h，再 加10 μL 的CCK8，孵 育3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測吸光值。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)課題組建立的BEECs 炎性反應(yīng)模型，利用1 μg/mL 的LPS 刺激3 h 使BEECs 發(fā)生炎癥反應(yīng)，換液后用合適濃度UA（5、10、20 μmol/L）處理BEECs 3 h。試驗(yàn)分為5 組，分別為空白對照組、LPS 組和LPS+UA（5、10、20 μmol/L）組，以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR 測mRNA 含量 用試劑盒提取各組中BEECs 總RNA，檢測RNA 濃度。試劑盒檢測mRNA 含量的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄3 min，95℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s 循環(huán)40 次。PCR反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2 × One Step SYBR Green Mix，1 μL One Step SYBR Enzyme Mix，0.4 μL 引物（10 μmol/L，序列見表1），2 μL RNA模板（20 ng/μL），RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL，檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表達(dá)。

表1 引物信息

1.5 蛋白免疫印跡分析 試劑盒提取各組細(xì)胞蛋白并測蛋白濃度，加入等體積的2×Buffer，95℃煮5 min。分別用10% 分離膠和5% 濃縮膠制作電泳凝膠板，每孔加入30 μg 樣品，電壓120 V，電泳70 min。切割凝膠在轉(zhuǎn)膜液中浸泡后，置于轉(zhuǎn)膜槽中，電流220 mA，轉(zhuǎn)膜90 min。5% 脫脂奶粉，搖床2 h 封閉；棄封閉液，TBST 洗3 次，將膜放入一抗孵育液中 4℃過夜?；厥找豢?，TBST 洗膜3 次，每次10 min；加入二抗（1:2000）孵育，搖床2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min；ECL 孵育、顯影并用Image J 計(jì)算各蛋白帶灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 8.0 的單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 和P＜0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 UA 對BEECs 活力的影響 如圖1 所示，與空白對照組相比，UA 濃度為100 μmol/L 時(shí)BEECs 的存活率極顯著降低。

圖1 UA 對BEECs 活力的影響

2.2 UA 對LPS 誘導(dǎo)BEECs 促炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平 的影響 由圖2 可知，LPS 刺 激后，IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表達(dá)水平較空白對照組均有提高（P＜0.01）；而加入U(xiǎn)A 后3 種促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平較LPS 組均下降（P＜0.01）。

圖2 UA 對LPS 誘導(dǎo)BEECs 促炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平的影響

2.3 UA 抑制BEECs炎性反應(yīng)中NF-κB通路相關(guān)蛋白含量的變化 如圖3 所示，用LPS 刺激BEECs 3 h 后，與空白對照組相比，p65 和IκBα的磷酸化水平顯著升高，IκBα的表達(dá)水平顯著降低；而在加入U(xiǎn)A 處理后，與空白對照組相比，p65 和IκBα的磷酸化水平顯著降低，IκBα的表達(dá)水平顯著升高，且與空白對照組表達(dá)水平基本相同，p65 蛋白含量未發(fā)生變化。

圖3 UA 對LPS 誘導(dǎo)BEECs NF-κB 信號通路的變化

3 討 論

奶牛子宮內(nèi)膜受到革蘭氏陰性菌侵襲，細(xì)菌釋放的LPS 被子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的TLR 識別，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使IκB激酶（IKK）活化，IKK 將IκB/NF-κB復(fù)合物中的IκB 亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，使得IκB 亞基被泛素化修飾，NF-κB p65 活化為p-p65 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，致使上述促炎因子轉(zhuǎn)錄，并翻譯大量TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)[9-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，1 μg/mL LPS 處理BEECs 3 h 后，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA 顯著升高，能夠促進(jìn)p65 和IκB 磷酸化。因此LPS 能夠代表革蘭氏陰性菌的侵襲作用，構(gòu)建奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)胞模型。

通過圍繞奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)胞模型進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，小檗堿、丹參酮等中藥單體能下調(diào)促炎性細(xì)胞因子，抑制子宮內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)[15-17]。UA 不論單獨(dú)使用，還是與其他藥物配合使用，均具有顯著治療病毒性肝炎[7]和抑制胃腫瘤細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)的作用[18]。本試驗(yàn)通過CCK-8 發(fā)現(xiàn)，UA 濃度在1～50 μmol/L 時(shí)對BEECs 活力無影響，UA 濃度為100 μmol/L 時(shí)BEECs的存活率較空白對照組極顯著降低，因此，本試驗(yàn)選用UA濃度是5、10、20 μmol/L處理BEECs 3 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

qRT-PCR 結(jié)果表明，LPS 刺激后，IL-6、TNF-α和IL-1β3 種促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平均極顯著提高，說明BEECs 發(fā)生了炎性反應(yīng)。而加入U(xiǎn)A 處理后，3 種促炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平均顯著下降，因此，可以認(rèn)為UA 可以抑制LPS 誘導(dǎo)BEECs 發(fā)生的炎性反應(yīng)。通過Western blot 結(jié)果表明，LPS 激活了BEECs炎性反應(yīng)中NF-κB 通路。而加入U(xiǎn)A 處理后能夠降低p65 磷酸化，并減少IκB 降解及磷酸化，說明作為抗氧化、抗炎的UA 能夠通過抑制NF-κB 信號通路減輕LPS 誘導(dǎo)BEECs 的炎性因子基因表達(dá)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS（1 μg/mL）刺激3 h 能誘導(dǎo)BEECs 炎性反應(yīng)，UA 可通過抑制NF-κB 信號通路減輕LPS 誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜炎細(xì)胞模型的炎性反應(yīng)，有望成為抗奶牛子宮內(nèi)膜炎的新型藥物。