韓 毅,于 艷,龔 偉,魏新智,鞠業(yè)濤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110032;*通訊作者,E-mail:95142012@qq.com)

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí),商品分為北五味和南五味(西五味),遼寧所產(chǎn)習(xí)稱(chēng)北五味,素有“遼五味”之稱(chēng),為遼寧的道地藥材?！侗静菥V目》記載:“遼東域之五味,油足性澀,乃為上品!異地均次之。”現(xiàn)代醫(yī)藥也把遼五味子列為上品,遼寧鞍山岫巖建有遼五味的種植基地,為遼五味的主要產(chǎn)地。中藥材特別是高品質(zhì)道地藥材長(zhǎng)期以來(lái)一直受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥、保健以及食品等行業(yè)的普遍關(guān)注,五味子是一種多功能、多用途的藥食兼用型經(jīng)濟(jì)植物,是藥材市場(chǎng)重點(diǎn)關(guān)注的品種之一。五味子市場(chǎng)需求量逐年增加,不但國(guó)內(nèi)大量需求,還出口到韓國(guó)、日本、新加坡等東南亞國(guó)家,所以對(duì)五味子的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究具有重要意義。

本試驗(yàn)選取遼寧鞍山岫巖種植基地生長(zhǎng)的不同年限,不同采收時(shí)間的10批藥材,參照2020年版《中國(guó)藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)岫巖遼五味子進(jìn)行顯微鑒別[1]和薄層鑒別,對(duì)雜質(zhì)、水分、總灰分進(jìn)行含量測(cè)定[2]。五味子化學(xué)成分研究表明,其成分為木脂素類(lèi)、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)油、黃酮等[3],其主要成分為木質(zhì)素類(lèi)[4,5],含量最高,2020年版《中國(guó)藥典》中以五味子醇甲作為五味子含量的檢測(cè)依據(jù),本實(shí)驗(yàn)除檢測(cè)五味子醇甲外,還對(duì)五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素3種指標(biāo)性成分進(jìn)行檢測(cè)[6],建立了岫巖遼五味子的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。目前關(guān)于五味子多指標(biāo)成分含量測(cè)定的研究較多[7],對(duì)特定地域所產(chǎn)的五味子進(jìn)行系統(tǒng)研究的較少,本研究建立岫巖遼五味子更全面的內(nèi)在質(zhì)量控制指標(biāo),對(duì)保證藥材質(zhì)量及臨床合理應(yīng)用具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

美國(guó)Agilent1100高效液相色譜儀,G1379A真空脫氣機(jī),G1311A四元梯度泵,G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1315柱恒溫箱,G1315B二極管陣列檢測(cè)器;Agilent B 04 03色譜工作站,CL-L生物顯微鏡,BL-420N生物信號(hào)采集處理系統(tǒng),ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),FX-400S型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧豐鑫超聲設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥及試劑

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)分別為110857-201010,110764-201111,110765-201512。五味子醇乙對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)為20120705。五味子對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)為120922-201610。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司),水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司),其余試劑均為分析純。中藥材均采自遼寧鞍山岫巖縣五味子種植基地,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定教研室李峰教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài)描述

落葉木質(zhì)藤本,長(zhǎng)可達(dá)8 m,小枝褐色。單葉互生,葉卵形、寬倒卵形至寬橢圓形,長(zhǎng)5-7 cm,邊緣疏生有腺體的細(xì)齒,上面有光澤,無(wú)毛(見(jiàn)圖1)?；▎涡?雌雄異株;單生或簇生葉腋,花被片粉白色或粉紅色,6-9片,乳白色或粉紅色;雄花具5雄蕊,花絲合生成短柱;雌花心皮17-40,花后花托逐漸伸長(zhǎng),果熟時(shí)呈穗狀聚合果。漿果球形,肉質(zhì),熟時(shí)深紅色(見(jiàn)圖1)?；ㄆ?-7月,果期6-9月。

圖1 岫巖遼五味子原植物及果實(shí)圖Figure 1 Graph of original plant and fruit of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.2 鑒別

2.2.1 藥材形狀鑒別 本品呈不規(guī)則的球形或扁球形,直徑5-8 mm。表面紅色、紫紅色或暗紅色,皺縮,顯油潤(rùn);有的表面呈黑紅色或出現(xiàn)“白霜”。果肉柔軟,種子1-2粒,腎形,表面棕黃色,有光澤,種皮薄而脆。果肉氣微,味酸(見(jiàn)圖2)。

圖2 岫巖遼五味子藥材Figure 2 Photograph of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.2.2 顯微鑒別 岫巖遼五味子粉末顯微特征:粉末暗紫色,種皮表皮石細(xì)胞表面觀呈多角形或長(zhǎng)多角形,大小頗均勻,直徑18-50 μm,長(zhǎng)至55-90 μm,壁厚6-25 μm,紋孔圓點(diǎn)狀或不明顯,壁厚,孔溝極細(xì)密,胞腔明顯,內(nèi)含棕色或棕黑色物(見(jiàn)圖3A)。種皮內(nèi)層石細(xì)胞,形體較大,常緊附于種皮表皮石細(xì)胞層,或單個(gè)散離,多破碎。呈類(lèi)多角形、類(lèi)圓形、卵圓形、長(zhǎng)橢圓形或不規(guī)則形,直徑25-83 μm,長(zhǎng)65-140 μm,壁厚13-38 μm,紋孔密而較大,呈點(diǎn)狀、短縫狀或叉狀,孔溝稍粗,胞腔明顯(見(jiàn)圖3B)。果皮表皮細(xì)胞表面觀類(lèi)多角形,垂周壁略呈連珠狀增厚,表面有角質(zhì)線紋;表皮中散有油細(xì)胞(見(jiàn)圖3C)。油細(xì)胞散在于表皮中,呈類(lèi)圓形或圓多角形,直徑約39-135 μm,壁稍厚,內(nèi)含揮發(fā)油滴(見(jiàn)圖3D)。中果皮細(xì)胞皺縮,界限不明顯,含暗棕色物,并含淀粉粒(見(jiàn)圖3E)。導(dǎo)管螺紋,偶有網(wǎng)紋(見(jiàn)圖3F)。內(nèi)胚乳細(xì)胞呈類(lèi)多角形,壁稍厚,內(nèi)含脂肪油滴(見(jiàn)圖3G)。

圖3 岫巖遼五味子粉末顯微特征Figure 3 Microscopic characteristics of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan powder

2.2.3 薄層色譜鑒別 取本品粉末1 g,加三氯甲烷20 ml,加熱回流30 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解,作為供試品溶液。另取五味子對(duì)照藥材1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。分別取五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加三氯甲烷制成每1 ml分別含五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲各1 mg的混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0502)試驗(yàn),吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各6 μl,對(duì)照品溶液2 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以石油醚(30-60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15 ∶5 ∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)(見(jiàn)圖4)。

S.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照條帶;1.五味子對(duì)照藥材溶液;2-11.10批次供試品溶液圖4 岫巖遼五味子薄層色譜圖Figure 4 Thin layer chromatogram of Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.3 雜質(zhì)、水分、總灰分的測(cè)定

參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則2301雜質(zhì)測(cè)定法測(cè)定,測(cè)得10批樣品中雜質(zhì)的量為0.4%-0.7%(見(jiàn)表1)。

參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則0832水分測(cè)定法第二法測(cè)定水分,測(cè)得10批藥材水分的含量為7.6%-14.7%(見(jiàn)表1)。

參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則2302灰分測(cè)定法總灰分測(cè)定法測(cè)定,測(cè)得10批樣品中總灰分的含量為2.8%-5.8%(見(jiàn)表1)。

表1 岫巖遼五味子中雜質(zhì)、水分、總灰分含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of impurity, water and total ash contents in Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.4 木脂素含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件及適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈為流動(dòng)相A,水為流動(dòng)相B,按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。理論塔板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000,分離度大于1.5。在上述色譜條件下,各組分分離度較好,各峰之間互不干擾。木脂素對(duì)照品及岫巖遼五味子樣品色譜圖見(jiàn)圖5。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子甲素;4.五味子乙素圖5 對(duì)照品與岫巖遼五味子樣品的HPLC圖Figure 5 High performance liquid chromatogram of reference substance and Liao Schisandra chinensis from Xiuyan

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品,加甲醇制成每1 ml分別含五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素各0.1 mg的溶液,搖勻,即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.3 g(過(guò)三號(hào)篩),精密稱(chēng)定,置25 ml量瓶中,加甲醇約20 ml,超聲處理(功率400 W,頻率40 kHz)30 min,取出,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4.4 提取條件考察

2.4.4.1 提取溶劑的考察 根據(jù)五味子醇甲等成分的化學(xué)性質(zhì)及查閱文獻(xiàn),本試驗(yàn)選用甲醇、乙醇、80%甲醇、三氯甲烷4種提取溶劑,采用超聲處理30 min的提取方式,再按上述色譜條件測(cè)定,考察4種木脂素成分的提取效率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取溶劑的考察結(jié)果 (mg/g)Table 3 Effect of extraction solvent on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.4.2 提取方法的考察 以甲醇為提取溶劑,采用超聲提取和加熱回流提取兩種方法,考察4種木脂素成分的提取效率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 提取方法的考察結(jié)果 (mg/g)Table 4 Effect of extraction method on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.4.3 提取時(shí)間的考察 以甲醇為提取溶劑,采用超聲處理的方法提取不同的時(shí)間,考察4種木脂素成分的提取效率,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 超聲提取時(shí)間的考察結(jié)果 (mg/g)Table 5 Effect of ultrasonic extraction time on contents of schisandrol A, schisandrol B, schisandrin A, schisandrin B (mg/g)

2.4.5 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.5.1 線性范圍考察 分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(含五味子醇甲0.110 8 mg/ml、五味子醇乙0.072 30 mg/ml、五味子甲素0.106 5 mg/ml、五味子乙素0.106 0 mg/ml)0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 ml,置5 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液及各稀釋液各20 μl,注入液相色譜儀中,記錄色譜峰面積。進(jìn)樣量X(μg)與色譜峰面積Y經(jīng)線性回歸,得回歸方程為:五味子醇甲Y=2 039X+23.44,r=0.999 9;五味子醇乙Y=1 616X+14.51,r=0.999 9;五味子甲素Y=1 963X+25.07,r=0.999 9;五味子乙素Y=1 696X+19.80,r=0.999 9。五味子醇甲在0.110 8-2.216 μg,五味子醇乙在0.072 30-1.445 μg,五味子甲素在0.106 5-2.130 μg,五味子乙素在0.106 0-2.120 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液5 μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果峰面積值的RSD分別為五味子醇甲0.4%,五味子醇乙0.5%,五味子甲素0.5%,五味子乙素0.5%,表明本方法精密度較好。

2.4.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6份,按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下分別制備成供試品溶液,按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定,結(jié)果平均含量分別為五味子醇甲6.830 mg/g、五味子醇乙1.580 mg/g、五味子甲素1.710 mg/g、五味子乙素2.890 mg/g,RSD分別1.9%,2.0%,2.7%,2.2%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別在0,2,4,6,8,10,12,14 h測(cè)定峰面積,結(jié)果峰面積RSD分別為五味子醇甲1.3%、五味子醇乙1.3%,五味子甲素1.3%,五味子乙素1.3%,表明本品溶液14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱(chēng)取6份已知含量的供試品0.15 g,精密稱(chēng)定,置25 ml量瓶中,分別精密加入混合對(duì)照品溶液(含五味子醇甲0.917 0 mg/ml、五味子醇乙0.217 0 mg/ml、五味子甲素0.310 0 mg/ml、五味子乙素0.313 0 mg/ml)1.0 ml,按供試品溶液制備方法制備,進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Table 6 Sample recovery test results (n=6)

2.4.6 樣品含量測(cè)定 取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩,產(chǎn)地均為岫巖遼五味子生產(chǎn)基地),按上述方法制備成供試品溶液,再按選定的色譜條件測(cè)定峰面積,用外標(biāo)法計(jì)算樣品中4種木脂素類(lèi)成分的含量,結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品中4種木脂素類(lèi)成分的含量測(cè)定結(jié)果Table 7 The contents of four lignans in the samples

根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果,暫定本品含量按干燥品計(jì)含五味子醇甲(C24H32O7)不少于0.4%,五味子醇乙(C23H28O7)、五味子甲素(C22H28O6)和五味子乙素(C23H28O6)的總量不少于0.4%。

3 討論

3.1 岫巖遼五味子薄層色譜研究

供試品點(diǎn)樣量選擇了2,4,6 μl,結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量在6 μl時(shí),斑點(diǎn)比較清晰。展開(kāi)距離選擇了4,6,8 cm,結(jié)果發(fā)現(xiàn)展距在4 cm時(shí),各組分分離度好,展距在8 cm時(shí),斑點(diǎn)出現(xiàn)變形現(xiàn)象,故選擇展距為4 cm,效果最佳。

3.2 岫巖遼五味子中木脂素提取方法選擇

根據(jù)五味子醇甲等成分的化學(xué)性質(zhì)及查閱文獻(xiàn)[8],本試驗(yàn)分別選用甲醇、乙醇、80%甲醇、三氯甲烷4種溶劑,采用超聲、加熱回流、提取時(shí)間考察4種木脂素成分的提取效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇提取效果最佳。以甲醇為提取溶劑,采用超聲和加熱回流兩種提取方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取效果最好。以甲醇為提取溶劑,采用超聲處理方法,考察超聲提取時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min與超聲提取60 min提取效率相差不多,為節(jié)省能源,故選擇超聲提取30 min。

岫巖遼五味子為遼寧高品質(zhì)道地中藥材規(guī)模化種植及精準(zhǔn)扶貧示范研究品種之一,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》五味子項(xiàng)下對(duì)雜質(zhì)、水分、總灰分的含量進(jìn)行檢測(cè)。采用顯微鑒別法、TLC鑒別法對(duì)樣品進(jìn)行鑒定,采用HPLC測(cè)定樣品中4種木脂類(lèi)指標(biāo)性成分的含量[9,10],對(duì)岫巖遼五味子進(jìn)行了初步研究,建立了內(nèi)在質(zhì)量控制指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上,逐步建立藥材的采收、加工、倉(cāng)儲(chǔ)、HPLC指紋圖譜等一系列深化研究[11],揭示道地藥材內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)越性,建立更全面的質(zhì)量控制指標(biāo),為北五味等道地藥材的規(guī)?；N植提供技術(shù)保障。