楊 洋，馬 媛，陳宥藝，周 娟，欒麗霞，趙 靜*

(1西安市人民醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710004；2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；3空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科；*通訊作者,E-mail:1968834452@qq.com)

子癇前期(preeclampsia，PE)嚴(yán)重威脅母兒健康，其發(fā)病率在全世界高達(dá)2%-8%[1]。病因不明導(dǎo)致的無(wú)法早期識(shí)別、預(yù)防，成為了PE臨床診治中的掣肘。近年來(lái)，圍繞著“子宮-胎盤功能障礙”的病因?qū)W研究逐步揭示了miRNA、免疫因素、血管形成因子、炎癥等[2]與PE發(fā)病的相關(guān)性，而上述的致病因素彼此相關(guān)、互相影響，構(gòu)成了綜合的病因?qū)W體系。

孕早期已發(fā)生的、包括滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)障礙及繼發(fā)的螺旋動(dòng)脈重鑄不足在內(nèi)的母胎界面中異常改變[3]，已經(jīng)成為PE發(fā)生的可能誘因。而dNK在母胎界面中，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫平衡、細(xì)胞毒作用、血管生成等諸多生理功能[4]，其中GM-CSF能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能及血管形成過(guò)程[5]。另外，我們前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，在PE胎盤組織中病理性高表達(dá)的miR-152能夠影響dNK分泌功能，并協(xié)同抑制滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)，與PE發(fā)病相關(guān)，但具體機(jī)制不明。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建dNK與過(guò)表達(dá)和抑制miR-152的人正常滋養(yǎng)細(xì)胞(HTR8)共培養(yǎng)體系，并在共培養(yǎng)過(guò)程中特異性封閉dNK表面相關(guān)受體(KIR2DL4)，采用管樣形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同共培養(yǎng)上清液干預(yù)下HUVEC的功能變化，從而進(jìn)一步探討miR-152以何種方式通過(guò)其靶基因HLA-G的介導(dǎo)，影響dNK分泌GM-CSF，是否還能夠協(xié)同參與對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的過(guò)程。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集2020年9月至2020年10月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科門診行人工流產(chǎn)患者的早孕蛻膜組織5例；患者年齡<35歲，BMI≤25 kg/m2，均為1胎正常順產(chǎn)、第2次妊娠因主觀無(wú)生育要求而終止妊娠的患者；所有患者既往無(wú)遺傳性、傳染性疾病及代謝性疾病病史；無(wú)妊娠期疾病史；無(wú)孕早期藥物、放射線及毒物接觸史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員同意并批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：XYLS2019095)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR8)由空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；F12K培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)于武漢普諾賽科技有限公司；miR-152前體及對(duì)照分子購(gòu)于上海吉瑪生物公司；TRIzol、lipofectamine2000、CD56、CD16單抗購(gòu)于美國(guó)invitrogen公司；HLA-G、β-actin單抗、HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)于天津?yàn)笊锟萍脊?；GM-CSF ELISA試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技公司；RT-qPCR試劑購(gòu)于美國(guó)VAZYME公司；matrigel膠、Transwell inserts購(gòu)于美國(guó)Costar公司；KIR2DL4單克隆抗體(anti-KIR2DL4)、IgG1同種型對(duì)照(IgG1為anti-KIR2DL4的對(duì)照物質(zhì)，應(yīng)用目的為排除anti-KIR2DL4本身是否對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響及評(píng)判其特異性封閉效果)購(gòu)于美國(guó)Abnova公司；重組人IL-15購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HTR8取出后解凍，接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞的密度達(dá)到80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR-8細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量，均勻的接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；將HTR8細(xì)胞分為：過(guò)表達(dá)組、抑制組和對(duì)照組。對(duì)照組采用未進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的HTR8作為對(duì)照；按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書，過(guò)表達(dá)組HTR8細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-152類似物(mimics)，抑制組HTR8細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-152抑制物(inhibitor)。

轉(zhuǎn)染后6 h于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(羧基熒光素酶FAM標(biāo)記對(duì)照)；48 h后RT-qPCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；并將轉(zhuǎn)染miR-152的各組HTR8細(xì)胞與后續(xù)提取的dNK共培養(yǎng)。

1.3.2 dNK細(xì)胞分離、純化 PBS沖洗蛻膜組織,眼科剪剪碎蛻膜組織至2 mm3左右,加入1 mg/ml膠原酶Ⅳ和0.01 mg/ml DNA酶Ⅰ充分混勻,37 ℃ 5%CO2飽和濕度條件下,消化1 h;按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離步驟。取分離后的細(xì)胞并計(jì)數(shù);每流式小管1×106個(gè)細(xì)胞,加入200 μl PBS重懸,每流式小管添加CD16和CD56,5 μl/Test,4 ℃孵育30 min;離心后加入200 μl PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。dNK的細(xì)胞表型為CD56+CD16-。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-152及其靶基因HLA-G表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h TRIzol法提取各組HTR-8細(xì)胞總RNA,并檢測(cè)質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物序列:miR-152上游5′-TGCGCTCAGTGCATGACAGAA-3′、下游5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;HLA-G上游5′-GGCCCACGCACAGACTGACAGAA-3′、下游5′-CCAGGTCGCAGCCAATCATCCAC-3′;U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′、下游5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′;β-actin上游5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′、下游5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′;反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以U6/β-actin為內(nèi)參,進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線,使用2-ΔΔCt法計(jì)算各組中目的基因miR-152、HLA-G mRNA水平的表達(dá)情況。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)miR-152靶基因HLA-G表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h提取各組HTR-8細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,以40 μg蛋白上樣量進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluo-ride, PVDF)上,封閉1 h;加抗HLA-G(1 ∶1 000)、抗β-actin(1 ∶500)抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后加二抗(1 ∶50 000),室溫孵育2 h。洗膜后,將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶溶液按1 ∶1比例混勻,滴加工作液于PVDF膜上,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),X線膠片壓片后顯影、定影,沖洗膠片;隨后掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.3.5 共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立 按照1.3.1中方法在6孔板中完成HTR-8轉(zhuǎn)染,隨后向6孔板中每孔加入1×106個(gè)dNK共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)共分6組:空白共培養(yǎng)組(NC共培養(yǎng)組)、miR-152過(guò)表達(dá)共培養(yǎng)組、miR-152過(guò)表達(dá)對(duì)照組、miR-152抑制共培養(yǎng)組、通路封閉共培養(yǎng)組、通路封閉對(duì)照組。因PE病理性胎盤組織中miR-152為病理性高表達(dá),故上述分組中僅設(shè)置了miR-152 mimics NC。

共培養(yǎng)過(guò)程中每組均加入20 ng/ml的IL-15(IL-15僅刺激dNK細(xì)胞活性,不影響細(xì)胞功能)。每組處理方式:空白共培養(yǎng)組(未轉(zhuǎn)染的HTR8+dNK)、miR-152過(guò)表達(dá)共培養(yǎng)組(轉(zhuǎn)染miR-152 mimics的HTR8+dNK)、miR-152過(guò)表達(dá)對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-152 mimics對(duì)照物的HTR8+dNK)、miR-152抑制共培養(yǎng)組(轉(zhuǎn)染miR-152 inhibitor的HTR8+dNK)、通路封閉共培養(yǎng)組(轉(zhuǎn)染miR-152 mimics的HTR8+dNK+KIR2DL4封閉劑)、通路封閉對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-152 mimics的HTR8+dNK+KIR2DL4封閉劑對(duì)照物IgG1)。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集上清,留待檢測(cè)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 ELISA檢測(cè)各共培養(yǎng)組上清中GM-CSF表達(dá) 將收集到的共培養(yǎng)24 h后6孔板中上清液離心;分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔;按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作,加樣后,酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度(OD值),檢測(cè)值代表各組上清中GM-CSF的表達(dá)水平。

1.3.7 管樣形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各共培養(yǎng)組上清對(duì)HUVEC功能影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,用F12K培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量,接種到6孔板中,37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜;用1.2.5中共培養(yǎng)24 h后的6組共培養(yǎng)上層培養(yǎng)液替換HUVEC培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;0.25%胰酶消化HUVEC,用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞,均勻接種到預(yù)鋪有基質(zhì)膠的24孔板中,37 ℃、5%CO2過(guò)夜培養(yǎng);培養(yǎng)8-12 h后拍照觀察,測(cè)量、記錄各組HUVEC總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 dNK細(xì)胞純度

流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示,分離純化的dNK細(xì)胞純度較高,約97.08%(見(jiàn)圖1)。

圖1 流式細(xì)胞分選dNK純度Figure 1 Purity of dNK cells after flow cytometry sorting

2.2 miR-152的轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中miR-152表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),抑制組細(xì)胞中miR-152表達(dá)降低(P<0.01,見(jiàn)圖2),提示miR-152在HTR8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果較好。

與對(duì)照組相比,*P<0.01圖2 miR-152在HTR8細(xì)胞中表達(dá)水平Figure 2 The expression level of miR-152 in HTR8 cells

2.3 過(guò)表達(dá)miR-152對(duì)其靶基因HLA-G表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中HLA-G在mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著降低(P<0.01);抑制組細(xì)胞中HLA-G在mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖3,表1)。表明miR-152可負(fù)性調(diào)控HTR8細(xì)胞中HLA-G在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。

表1 HLA-G在mRNA和蛋白水平的表達(dá)Table 1 Expression of HLA-G at mRNA and protein levels

圖3 HLA-G在蛋白水平表達(dá)Figure 3 HLA-G protein expression in three groups

2.4 ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)24 h后上清中GM-CSF的表達(dá)

ELISA檢測(cè)6組共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子GM-CSF的濃度,結(jié)果顯示:與空白共培養(yǎng)組相比,miR-152過(guò)表達(dá)共培養(yǎng)組、miR-152過(guò)表達(dá)對(duì)照組、通路封閉共培養(yǎng)組、通路封閉對(duì)照物組上清中的GM-CSF濃度均降低(P<0.01);其中,通路封閉共培養(yǎng)組上清中GM-CSF的濃度最低(P<0.01,見(jiàn)圖4)。提示在過(guò)表達(dá)miR-152的前提下,同時(shí)封閉KIR2DL4受體,能夠嚴(yán)重抑制dNK分泌GM-CSF。與空白共培養(yǎng)組相比,miR-152抑制共培養(yǎng)組上清中GM-CSF的濃度增高(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

與空白共培養(yǎng)組相比,**P<0.01;與通路封閉對(duì)照組相比，△△P<0.01圖4 與轉(zhuǎn)染miR-152 mimics及inhibitor的HTR8分別共培養(yǎng)且封閉HLA-G/KIR2DL4通路后dNK分泌GM-CSF的水平變化Figure 4 Changes of GM-CSF secreted by dNK after the co-culture with HTR8 transfected with miR-152 mimics and inhibitor and block of HLA-G/KIR2DL4 pathyway

2.5 共培養(yǎng)后對(duì)HUVEC血管形成能力的影響

管樣形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白共培養(yǎng)組比較,通路封閉共培養(yǎng)組上清干預(yù)后的HUVEC細(xì)胞的管腔形成能力,包括總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均明顯降低(P<0.01);miR-152抑制共培養(yǎng)組上清干預(yù)后的HUVEC細(xì)胞的管腔形成能力,包括總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均明顯增高(P<0.01,見(jiàn)圖5)。

圖5 各組HUVEC血管形成能力情況 (×200)Figure 5 HUVEC blood vessel formation ability in each group (×200)

3 討論

PE多發(fā)生于妊娠20周之后,病情可呈持續(xù)性進(jìn)展,任何程度的PE均可導(dǎo)致母兒嚴(yán)重不良預(yù)后[8]。PE的發(fā)病機(jī)制尚未明確,滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙、胎盤灌注不良-母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[9],以及微小RNA[10]、微環(huán)境介質(zhì)[11]、免疫[12]等因素的綜合作用均被發(fā)現(xiàn)參與了PE發(fā)病過(guò)程;而在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能調(diào)節(jié)方式精密的母胎界面中的異常改變[13],則可能在PE的發(fā)病過(guò)程中起到了“源頭樣”作用。

PE的發(fā)生源自由蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜免疫細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞組成的母胎界面[14]。dNK為母胎界面中重要的免疫細(xì)胞組分,能夠受到miRNA的間接調(diào)控,與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、PE等發(fā)病相關(guān)[6,7]。項(xiàng)目組前期發(fā)現(xiàn),在PE胎盤組織中病理性高表達(dá)的miR-152能夠協(xié)同dNK抑制滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)[6],但機(jī)制不明。miR-152能夠在蛋白水平靶向調(diào)控HLA-G已在人絨毛膜癌細(xì)胞中得到明確[15],本研究在HTR8中驗(yàn)證了miR-152能夠在mRNA及蛋白水平負(fù)性調(diào)控HLA-G,這與既往研究趨勢(shì)一致。

HLA-G作為KIR2DL4的唯一配體[16],主要分布于母胎界面的絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞表面,兩者間特異性結(jié)合能夠傳遞免疫信號(hào)。KIR2DL4為殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)家族成員,其作為NK細(xì)胞表面的重要受體,同時(shí)發(fā)揮活化NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子,以及抑制激活NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用;HLA-G與KIR2DL4的結(jié)合則會(huì)促進(jìn)NK細(xì)胞分泌功能,抑制其殺傷活性,從而有利于維系正常妊娠[17]。本研究從人正常早孕蛻膜組織中提取到了純度較高的dNK,并構(gòu)建了過(guò)表達(dá)與抑制miR-152的HTR8和dNK的共培養(yǎng)體系,且在培養(yǎng)過(guò)程中特異性封閉KIR2DL4受體;后續(xù)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中GM-CSF結(jié)果顯示,與空白共培養(yǎng)組相比,通路封閉共培養(yǎng)組上清中GM-CSF的濃度最低(P<0.01);miR-152過(guò)表達(dá)共培養(yǎng)組、miR-152過(guò)表達(dá)對(duì)照組、通路封閉對(duì)照組在過(guò)表達(dá)miR-152的前提條件下,各組上清中GM-CSF的濃度也均分別低于空白共培養(yǎng)組(P<0.01);而抑制miR-152表達(dá)后,上清中GM-CSF的濃度高于空白共培養(yǎng)組(P<0.01)。以上結(jié)果提示,PE時(shí)病理性高表達(dá)的miR-152因?qū)ζ浒谢虻呢?fù)向調(diào)控作用,導(dǎo)致HLA-G低表達(dá),從而降低了其與dNK細(xì)胞表面KIR2DL4受體的正常結(jié)合率,進(jìn)一步影響dNK分泌功能,導(dǎo)致細(xì)胞因子GM-CSF的水平下降。

后續(xù)細(xì)胞功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):通路封閉共培養(yǎng)組上清干預(yù)后,HUVEC的管腔形成能力,包括總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)明顯降低(P<0.01);miR-152抑制共培養(yǎng)組上清干預(yù)后,HUVEC的管腔形成能力增強(qiáng)(P<0.01)。上述結(jié)果提示當(dāng)dNK分泌GM-CSF受到抑制后,可影響血內(nèi)皮細(xì)胞成管過(guò)程。GM-CSF除經(jīng)典的造血前體刺激樣作用外,還對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)控作用[18],影響多種細(xì)胞的增殖和遷移等功能;在小鼠創(chuàng)傷修復(fù)模型中,GM-CSF可促進(jìn)有絲分裂,加速新生血管形成[19];此外,Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn),dNK能夠通過(guò)鞘氨醇信號(hào)通路以及其表面受體活化后分泌的GM-CSF,參與滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、血管生成、螺旋動(dòng)脈重鑄等調(diào)控過(guò)程,這既與我們的發(fā)現(xiàn)部分一致,也能夠進(jìn)一步解釋共培養(yǎng)條件下細(xì)胞功能改變的部分機(jī)制。

綜上,提示:miR-152可能在HLA-G/KIR2DL4通路的介導(dǎo)下,影響dNK分泌功能,使母胎界面免疫微環(huán)境中GM-CSF等細(xì)胞因子發(fā)生改變,進(jìn)而抑制HUVEC血管形成能力,誘發(fā)后續(xù)胎盤血管重塑形成障礙,最終導(dǎo)致PE發(fā)生。通過(guò)本研究,為PE的病因?qū)W研究和臨床防治,提供了部分實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。