劉 哲,王 旖,溫玉婷,袁 慧,朱夏茹,杜軍輝,*

(1西安市第九醫(yī)院交叉醫(yī)學(xué)研究室,西安 710054;2西安市第九醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心;3西安市第九醫(yī)院眼視光中心;*通訊作者,E-mail:djh79918@163.com)

趨化素(chemerin)是一種脂肪細(xì)胞因子,在許多疾病中發(fā)揮重要生理病理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn),多囊卵巢綜合征患者外周血chemerin水平明顯升高[1],在多種與糖尿病相關(guān)的疾病中表達(dá)水平異常,如妊娠期糖尿病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)等[2-5]。趨化因子樣受體1(chemokine-like receptor 1,CMKLR1)是chemerin的受體,兩者結(jié)合可以產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn),DR患者血清chemerin表達(dá)水平升高[5],提示chemerin可能參與了DR的進(jìn)展。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells, RPE)在許多眼底疾病中發(fā)揮重要作用,其病理改變參與眼底病變的發(fā)生及發(fā)展。近年來,研究表明,自噬與炎癥在DR進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[6-10]。在以往研究中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與DR密切相關(guān),參與病變的進(jìn)展[11-13]。在動物模型中發(fā)現(xiàn)IL-1β在糖尿病大鼠血清和視網(wǎng)膜中表達(dá)升高[11,12],TNF-α在DR患者血清中表達(dá)水平升高,是DR發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素[13],與DR病情嚴(yán)重程度有關(guān)[14]。關(guān)于Chemerin/CMKLR1對RPE細(xì)胞IL-1β、TNF-α表達(dá)及自噬的影響尚不清楚。因此,本研究旨在探討Chemerin/CMKLR1對RPE表達(dá)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(ARPE-19細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,重組人脂肪因子chemerin購于美國PeproTech公司,LC3、Beclin-1購于美國CST公司,IL-1β、TNF-α購于美國CST公司,α-NETA購于美國MCE公司,其他細(xì)胞培養(yǎng)耗材、試劑購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

按細(xì)胞培養(yǎng)說明書培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞株,ARPE-19細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)液,其中添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素,于37 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量為80%-90%時,胰蛋白酶消化ARPE-19細(xì)胞,1 600 r/min離心5 min,收集、重懸并培養(yǎng)細(xì)胞。將ARPE-19細(xì)胞分為7組檢測細(xì)胞增殖情況,分別是:空白對照組、1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組、1 nmol/L chemerin+α-NETA組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組、100 nmol/L chemerin+α-NETA組?？瞻讓φ战MARPE-19細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h。1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組分別使用終濃度為1,10,100 nmol/L chemerin處理ARPE-19細(xì)胞20 min,換液加入RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h。1 nmol/L chemerin+α-NETA組、10 nmol/Lm chemerin+α-NETA組、100 nmol/Lm chemerin+α-NETA組分別使用終濃度為1,10,100 nmol/L chemerin處理ARPE-19細(xì)胞20 min,換液加入1.25 μmol/Lα-NETA處理48 h。

將細(xì)胞隨機(jī)分為5組檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1,分別是:空白對照組、1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組。將細(xì)胞分為3組檢測細(xì)胞遷移和IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平,分別是:空白對照組、10 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組。根據(jù)不同分組處理細(xì)胞后,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 CCK8法檢測ARPE-19細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期ARPE-19細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml,96孔板每孔接入100 μl細(xì)胞懸液,37 ℃培養(yǎng)過夜,根據(jù)1.2所述細(xì)胞分組情況將細(xì)胞隨機(jī)分為7組,分別使用不同濃度chemerin及α-NETA處理ARPE-19細(xì)胞,換液加入RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,每組3個復(fù)孔,37 ℃培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK8,37 ℃培養(yǎng)4 h;酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD 450。

1.4 Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)

根據(jù)1.2所述細(xì)胞分組處理細(xì)胞后,分別收集各組ARPE-19細(xì)胞,裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h;將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,隨后進(jìn)行免疫印跡顯色,用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,GAPDH(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶2 000)、Beclin-1(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。漂洗后加入用HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。晾干膠片,掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.5 Transwell檢測ARPE-19細(xì)胞遷移

取ARPE-19細(xì)胞,0.25%胰酶消化收集,用無血清培養(yǎng)基稀釋ARPE-19細(xì)胞濃度至1×105/ml,備用;在24孔板中預(yù)先加入800 μl含10%FBS的培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,1 h后在Transwell上室分別接入細(xì)胞懸液200 μl(根據(jù)1.2所述細(xì)胞分組情況進(jìn)行分3組處理),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;取出Transwell,用PBS清洗后加入10%甲醇溶液固定ARPE-19細(xì)胞30 min;小心切下膜,在膜上滴50 μl 5%結(jié)晶紫染液,室溫中放置20 min,PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Western blotting檢測IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)

根據(jù)1.2所述細(xì)胞分組情況收集各組ARPE-19細(xì)胞,裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h;將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,隨后進(jìn)行免疫印跡顯色,用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,GAPDH(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。漂洗后加入用HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000),使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。晾干膠片,掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS19.0軟件進(jìn)行結(jié)果整理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法,以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

使用CCK8法檢測了不同處理組ARPE-19細(xì)胞的增殖情況,在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,結(jié)果表明:與空白對照組相比,1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)(P<0.05);與1 nmol/L chemerin組相比,1 nmol/L chemerin+α-NETA組細(xì)胞的增殖受到抑制(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組細(xì)胞的增殖受到抑制(P<0.05);與100 nmol/L chemerin組相比,100 nmol/L chemerinα-NETA組細(xì)胞的增殖受到抑制(P<0.05,見圖1)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與各自對相應(yīng)濃度組比較,#P<0.05圖1 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of Chemerin/CMKLR1 on the proliferation of ARPE-19 cells

2.2 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示:與空白對照組相比,1 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin組、100 nmol/L chemerin組LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerinα-NETA組LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.3 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞遷移的影響

Transwell檢測ARPE-19細(xì)胞遷移結(jié)果顯示:空白對照組、10 nmol/L chemerin組、10 nmol/L chemerin+α-NETA組細(xì)胞遷移數(shù)分別是50.8±8.1,67.8±6.9,41.6±6.3。與空白對照組相比,10 nmol/L chemerin組細(xì)胞遷移數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組細(xì)胞遷移數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖2 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞LC3、Beclin-1的影響Figure 2 Effects of Chemerin/CMKLR1 on LC3 and Beclin-1 in ARPE-19 cells

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖3 Chemerin/CMKLR1對細(xì)胞遷移的影響 (×200)Figure 3 Effect of Chemerin/CMKLR1 on cell migration (×200)

2.4 Western blotting檢測Chemerin/CMKLR1對炎癥因子IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示:與空白對照組相比,10 nmol/L chemerin組IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與10 nmol/L chemerin組相比,10 nmol/L chemerin+α-NETA組IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與空白對照組相比,*P<0.05;與10 nmol/L chemerin組相比,#P<0.05圖4 Chemerin/CMKLR1對ARPE-19細(xì)胞IL-1β、TNF-α的影響Figure 4 Effects of Chemerin/CMKLR1 on IL-1β and TNF-α in ARPE-19 cells

3 討論

RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜中發(fā)揮重要生理作用的一種細(xì)胞,能夠表達(dá)多種細(xì)胞因子,如:炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,RPE細(xì)胞受損參與很多眼底疾病的發(fā)展,包括年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、DR等。本研究結(jié)果表明,Chemerin/CMKLR1能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-1β、TNF-α,可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)而促進(jìn)DR的進(jìn)展。以往研究表明[15],DR患者體內(nèi)存在炎癥反應(yīng),這是導(dǎo)致DR進(jìn)展的一個重要因素。CMKLR1是chemerin的功能性受體,在許多組織中均有表達(dá),主要表達(dá)于脂肪組織和肺,血管內(nèi)皮細(xì)胞也存在CMKLR1受體,我們的研究證實了RPE細(xì)胞也能夠表達(dá)CMKLR1受體。以往研究發(fā)現(xiàn),IL-1β、TNF-α與DR密切相關(guān),參與病變的進(jìn)展[16,17]。在動物模型中發(fā)現(xiàn)IL-1β在糖尿病大鼠血清和視網(wǎng)膜中表達(dá)升高[11,12],在增殖性DR組織中呈高表達(dá),能夠通過上調(diào)炎性因子與氧化因子表達(dá)水平等多種途徑促進(jìn)DR進(jìn)展[16,18]。TNF-α在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中也呈現(xiàn)高表達(dá)[19],在DR患者血清中,TNF-α表達(dá)水平同樣升高,是DR發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素[13],與DR病情嚴(yán)重程度有關(guān)[14]。IL-1β、TNF-α能夠通過促進(jìn)炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)DR的進(jìn)展。我們的研究結(jié)果證實了Chemerin/CMKLR1可能通過上調(diào)炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)促進(jìn)DR進(jìn)展。

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)形成是增生性DR的主要病理改變。近年來發(fā)現(xiàn)自噬在新生血管形成中發(fā)揮重要作用[20-22]。我們研究結(jié)果表明,Chemerin/CMKLR1能夠促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的表達(dá),表明Chemerin/CMKLR1能夠啟動RPE細(xì)胞自噬的激活。這與其他研究結(jié)果一致[23],以往研究還表明,自噬的激活能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞表達(dá)及分泌VEGF,進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成[24]。結(jié)合上述研究結(jié)果表明Chemerin/CMKLR1可能通過激活自噬,進(jìn)而促進(jìn)VEGF表達(dá),促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂、遷移,最終促進(jìn)新生血管形成,進(jìn)而參與增生性DR的病理進(jìn)展。此外,Chemerin及其受體CMKLR1可能通過多條途徑激活自噬有,比如:通過上調(diào)ROS表達(dá)激活自噬,通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)激活自噬等[23]。我們的研究表明Chemerin/CMKLR1能夠促進(jìn)RPE細(xì)胞增殖和遷移。而RPE細(xì)胞增殖和遷移在增生性DR的發(fā)展中起到重要作用,能夠促進(jìn)眼底增殖膜的形成。因此,這也是Chemerin/CMKLR1促進(jìn)增生性DR進(jìn)展的重要因素。

綜上所述,chemerin/CMKLR1能夠激活RPE細(xì)胞自噬、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá),進(jìn)而參與并促進(jìn)DR的進(jìn)展。本研究主要研究了自噬起始階段的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況,未對自噬流、自噬溶酶體功能進(jìn)行檢測,這是研究的不足之處。我們計劃下一步對此進(jìn)行研究,并在動物模型體內(nèi)對細(xì)胞研究結(jié)果進(jìn)行驗證。