熊 蘭，盧元明

(四川省廣元市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣元 628000)

多發(fā)性硬化癥是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。多發(fā)性硬化引起炎癥，軸突脫髓鞘和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)退行性病變。多發(fā)性硬化癥病理生理機(jī)制復(fù)雜，炎癥和軸突脫髓鞘可能起重要致病作用[1]。在多發(fā)性硬化動(dòng)物模型中，抑制促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin,IL-1β)和IL-6與疾病嚴(yán)重程度降低有關(guān)[2]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究多發(fā)性硬化癥最常用的動(dòng)物模型之一。定期運(yùn)動(dòng)可通過增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)來抑制致病性感染[3]。其中游泳運(yùn)動(dòng)可提高肌肉耐力，促進(jìn)抗炎作用，并具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]。與跑步運(yùn)動(dòng)相比，游泳運(yùn)動(dòng)可以提高適應(yīng)能力，產(chǎn)生更多的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。但是游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)EAE患者神經(jīng)保護(hù)作用仍不明確。因而，本研究旨在評(píng)估游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)誘導(dǎo)EAE大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性8-10周齡SD大鼠，體質(zhì)量(210±5)g，購于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠自由飲水和進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理和福利(動(dòng)物倫理編號(hào):2019DW113)嚴(yán)格執(zhí)行。將SD大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、EAE組、EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β-干擾素組，每組各10只大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

冷凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；MOG(美國(guó)Sigma公司)；盧克索固藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)；β-干擾素(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；TUNEL試劑盒(瑞士羅氏公司)；髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein,PLP)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)抗體(美國(guó)Santa公司)。

1.3 方法

1.3.1 EAE模型制備及干預(yù)方法 如前所述，將50 μg純化MOG33-55溶解在200 μl生理鹽水中，用弗氏完全佐劑(結(jié)核桿菌)使其均勻化(1 ∶1)，MOG33-55經(jīng)尾基部皮內(nèi)注射[6]。對(duì)照組在相同時(shí)間注射生理鹽水。從EAE造模成功后5 d，游泳運(yùn)動(dòng)組大鼠游泳30 min，每天一次，連續(xù)26 d。EAE造模成功后5 d，β-干擾素組大鼠腹腔注射30萬U的β-干擾素，每天一次，為期26 d(與游泳運(yùn)動(dòng)計(jì)劃相同)。

1.3.2 神經(jīng)功能評(píng)分 EAE造模成功后監(jiān)測(cè)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，每2 d一次，持續(xù)30 d(14次，不包括EAE誘導(dǎo)前一次預(yù)測(cè)試)。神經(jīng)功能評(píng)分如下：0分為無臨床體征，1分為尾癱(或尾音喪失)，2分為尾癱和后肢無力，3分為完全后肢無力，4分為完全后肢和前肢無力[6]。

1.3.3 旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)分析運(yùn)動(dòng)功能 將大鼠置于旋轉(zhuǎn)裝置中的旋轉(zhuǎn)桿(直徑為7 cm，固定速度為30 r/min)上單獨(dú)隔間中。用磁跳板自動(dòng)記錄跌倒?jié)摲凇榱讼龎毫推?，我們將大鼠潛伏期限制?00 s內(nèi)。

1.3.4 握力試驗(yàn)分析肌力 將大鼠放置在一根懸空(高度為50 cm)鋼條(直徑為0.15 cm)上，大鼠會(huì)用四只爪子抓緊鋼條，記錄大鼠由放置到掉下來的時(shí)間。測(cè)試3次，取其平均值。

1.3.5 脫髓鞘評(píng)分 在EAE誘導(dǎo)后31 d處死大鼠。心臟灌注大鼠后取腰段脊髓切取20 μm冠狀切片。將腰椎脊髓切片貼于明膠涂層玻片上。將載玻片脫水并與0.1%盧克索固藍(lán)在95%乙醇和冰醋酸中孵育過夜(56 ℃)。玻片在0.1%碳酸鋰和70%乙醇中依次分化。連接到光學(xué)顯微鏡上計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)，分析每張玻片上4個(gè)區(qū)域是否存在脊髓脫髓鞘。脫髓鞘評(píng)分定義如下：0分表示正常，1分表示1個(gè)小局灶性脫髓鞘區(qū)域，2分表示2個(gè)或3個(gè)脫髓鞘區(qū)域，3分表示1-2個(gè)大的脫髓鞘區(qū)域，4分表示廣泛脫髓鞘，涉及超過20%白質(zhì)[7]。

1.3.6 ELISA分析促炎細(xì)胞因子 按照ELISA試劑盒規(guī)定的步驟，檢測(cè)各組大鼠腰段脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子濃度。

1.3.7 Western blotting分析MB、PLP和NGF 提取各組大鼠腰段脊髓，按10 ml/g比例加入全細(xì)胞裂解液，勻漿、超聲破碎，BCA法進(jìn)行蛋白定量，制備成電泳樣品。取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶孵育1 h。分別用兔源MBP(1 ∶1 000)、PLP(1 ∶1 000)和NGF(1 ∶1 000)4 ℃孵育3 h。用山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h。采用Quantity one圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶吸光度積值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分影響

EAE誘導(dǎo)后9 d出現(xiàn)尾癱或后肢無力，神經(jīng)功能評(píng)分顯著增加，直至誘導(dǎo)后21 d(均P<0.01，見圖1)。游泳運(yùn)動(dòng)改善了EAE癥狀，使神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(均P<0.01，見圖1)。游泳運(yùn)動(dòng)組和β-干擾素組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能和肌力影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAE組跌倒?jié)摲诤臀樟档?均P<0.05)；與EAE組相比，EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β干擾素組跌倒?jié)摲诤臀樟黾?均P<0.05，見圖2，3)，但EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β-干擾素組大鼠潛伏期和握力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與EAE組比較，#P<0.05圖1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠神經(jīng)功能影響Figure 1 Effect of swimming on neural function in rats

2.3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠促炎細(xì)胞因子表達(dá)影響

與對(duì)照組相比，EAE組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)增加(均P<0.05)；與EAE組相比，EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β干擾素組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)降低(均P<0.05，見表1)，但游泳運(yùn)動(dòng)組和β-干擾素組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與EAE組比較，#P<0.05圖2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠跌倒?jié)摲谟绊?(n=10)Figure 2 Effect of swimming on fall latency in rats (n=10)

表1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠促炎細(xì)胞因子影響Table 1 Effect of swimming on proinflammatory cytokines in rats

2.4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠脫髓鞘評(píng)分影響

與對(duì)照組相比，EAE組大鼠脫髓鞘評(píng)分升高(P<0.05)。與EAE組相比，EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β干擾素組大鼠脫髓鞘評(píng)分顯著降低(均P<0.05，見圖4)，但游泳運(yùn)動(dòng)組和β-干擾素組大鼠脫髓鞘評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠NGF、MBP和PLP表達(dá)影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAE組大鼠腰髓NGF、MBP和PLP表達(dá)降低(均P<0.05)。與EAE組相比，EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組和EAE+β干擾素組大鼠NGF、MBP和PLP表達(dá)增加(均P<0.05，見圖5和表2)，但游泳運(yùn)動(dòng)組和β干擾素組大鼠NGF、MBP和PLP表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠NGF、MBP和PLP表達(dá)比較Table 2 Effects of swimming on the expression of NGF, MBP and PLP in rats

3 討論

本研究結(jié)果顯示，大鼠注射MOG33-55可增加神經(jīng)功能評(píng)分，降低運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和肌力。我們的研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果相同，顯示MOG33-55增加了神經(jīng)功能評(píng)分和運(yùn)動(dòng)功能障礙[8]。EAE誘導(dǎo)通過增加促炎性細(xì)胞因子和炎性滲出物水平促進(jìn)軸突損傷[9]。在本研究中，腰椎脊髓部位促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)增加可能歸因于EAE誘導(dǎo)。本研究結(jié)果也表明，EAE癥狀會(huì)因促炎性細(xì)胞因子過度產(chǎn)生而惡化。規(guī)律體育鍛煉可減少神經(jīng)元變性和炎癥[9]。特別是慢性體育鍛煉可能會(huì)進(jìn)一步影響先天免疫系統(tǒng)各種細(xì)胞數(shù)量，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[10]。另外還有研究表明，淋巴細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)期間和運(yùn)動(dòng)后增加，影響T細(xì)胞和B細(xì)胞，并調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡[10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)顯著抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，其程度與β-干擾素治療相同。游泳運(yùn)動(dòng)在EAE誘導(dǎo)10 d后促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)并減少促炎環(huán)境，減輕嚙齒動(dòng)物EAE癥狀嚴(yán)重程度[11]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。多發(fā)性硬化患者腦內(nèi)MBP自催化作用增強(qiáng)可能有助于免疫顯性表位產(chǎn)生。MBP降低表明多發(fā)性硬化癥脫髓鞘狀態(tài)[12]。同樣，PLP在髓鞘致密、穩(wěn)定和維持，以及少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和軸突存活中發(fā)揮作用，因此，EAE中PLP減少表明脫髓鞘[13]。NGF可通過髓鞘生物合成促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康。腦NGF增加可能有助于抑制EAE嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)丟失，并減弱疾病進(jìn)展[14]。在本研究結(jié)果中，注射MOG33-55后，MBP、PLP和NGF表達(dá)降低，表明EAE誘導(dǎo)脫髓鞘。最終，MBP、PLP和NGF表達(dá)降低增加了腰椎脊髓區(qū)域脫髓鞘評(píng)分。體育運(yùn)動(dòng)通過平衡輔助性T細(xì)胞-1和輔助性T細(xì)胞-2來調(diào)節(jié)免疫[15]，從而減少EAE脫髓鞘和炎癥反應(yīng)。運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)成分，減少自體反應(yīng)細(xì)胞穿過血腦屏障進(jìn)入腰脊髓運(yùn)動(dòng)[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在MOG33-55誘導(dǎo)EAE大鼠中，游泳運(yùn)動(dòng)增加了MBP、PLP和NGF表達(dá)。此外，游泳運(yùn)動(dòng)降低了腰椎脊髓區(qū)域脫髓鞘評(píng)分。

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與EAE組比較，#P<0.05圖4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠脫髓鞘評(píng)分影響 (n=10)Figure 4 Effect of swimming on demyelination score in rats (n=10)

1.對(duì)照組;2.EAE組;3.EAE+游泳運(yùn)動(dòng)組;4.EAE+β干擾素組圖5 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠NGF、MBP和PLP表達(dá)影響Figure 5 Effect of swimming on NGF, MBP and PLP in each group by immunoblotting

總之，本研究結(jié)果表明，游泳運(yùn)動(dòng)可能通過調(diào)節(jié)腰髓NGF、MBP和PLP蛋白表達(dá)抑制MOG33-55誘導(dǎo)的EAE大鼠炎癥和脫髓鞘，改善運(yùn)動(dòng)功能和臨床損害。