張祉思 程婉秋 江濤 沈志濱 陳艷芬 陳聰 司徒瑩 唐春萍

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2854-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.07

摘 要 目的：研究滇烏堿誘導(dǎo)大鼠心律失常的毒性機(jī)制。方法：將32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組，滇烏堿低、高劑量組（0.09、0.14 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對(duì)照，0.88 mg/kg），每組8只。各給藥組大鼠每天灌胃相應(yīng)藥物1次，正常對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次灌胃后，觀察各組大鼠的心電圖變化，測(cè)定大鼠心肌組織中腺苷三磷酸（ATP）含量、心肌細(xì)胞中Ca2+含量、心肌組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及雷諾定受體2（RyR2）、Ca2+-ATP酶（SERCA2）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠QRS波時(shí)限、校正后QT期間（QTc間期）均顯著延長（P<0.01），心肌細(xì)胞中Ca2+含量顯著升高（P<0.05），心肌組織中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和SERCA2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心率均顯著增快（P<0.05或P<0.01），QRS波時(shí)限、QTc間期均顯著延長（P<0.01），心肌細(xì)胞中Ca2+含量均顯著升高（P<0.01），心肌組織中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：滇烏堿可導(dǎo)致大鼠心律失常;其作用機(jī)制可能與降低心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下調(diào)心肌組織中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)yR2、SERCA2的表達(dá)，從而導(dǎo)致Ca2+超載有關(guān)。

關(guān)鍵詞 滇烏堿;心律失常;鈣超載;腺苷三磷酸;雷諾定受體2;Ca2+-ATP酶;毒性機(jī)制

Study on the Toxicity Mechanism of Yunaconitine-induced Arrhythmia in Rats Based on Calcium Overload

ZHANG Zhisi1，CHENG Wanqiu1，JIANG Tao2，SHEN Zhibin1，CHEN Yanfen1，CHEN Cong1，SITU Ying1，TANG Chunping1，3（1.School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Laboratory Animal Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Guangdong Engineering Research Center for Local Precise Drug Delivery， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the toxicity mechanism of yunacotine-induced arrhythmia in rats. METHODS： Totally 32 rats were randomly divided by random number table method into normal control group， yunacotine low-dose and high-dose groups （0.09， 0.14 mg/kg）， aconitine group （positive control， 0.88 mg/kg）， with 8 rats in each group. Administration groups were given the corresponding drugs once a day， and normal control group was given the constant volume of normal saline， for consecutive 7 d. After last intragastric administration， the changes of electrocardiogram （ECG） were observed. The contents of adenosine triphosphate （ATP） in myocardial tissue and Ca2+ in myocardial cells， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase as well as the protein expression of ranolidine receptor 2 （RyR2） and Ca2+-ATPase （SERCA2） in myocardial tissue were determined. RESULTS： Compared with normal control group， time limit of QRS wave and QTc intervals of rats were prolonged significantly in yunaconitine low-dose group （P<0.01）. The content of Ca2+ in myocardial cells， the ATP contents， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase as well as the protein expression of SERCA2 in myocardial tissue were reduced significantly （P<0.05 or P<0.01）. The heart rate of rats in yunaconitine high-dose group and aconitine group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and time limit of QRS wave and QTc intervals were significantly prolonged （P<0.01）; the content of Ca2+ in myocardial cells was increased significantly （P<0.01）; ATP content， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase， and protein expression of RyR2 and SERCA2 in myocardial tissue were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Yunaconitine can induce arrhythmia in rats， the mechanism of which may be associated with Ca2+ overload that resulted from reducing the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase and down-regulating the expression of related calcium transporter RyR2 and SERCA2.

KEYWORDS? ?Yunaconitine; Arrhythmia; Calcium overload; Adenosine triphosphate; Ryanodine receptor 2; Ca2+ ATPase; Toxicity mechanism

黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom.為毛莨科烏頭屬多年生草本植物的干燥塊根[1]，具有祛風(fēng)散寒、活血止痛的功效，臨床用于治療風(fēng)寒濕痹、跌打損傷和風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛等[2]，被收載于2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃草烏及其炮制品都有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但其毒性劑量和療效劑量接近，限制了其在臨床的廣泛使用[4]。滇烏堿是從黃草烏中提取、分離得到的主要藥效成分，但也是毒性成分[5]。溫玉瑩等[6]的研究結(jié)果顯示，黃草烏經(jīng)十二指腸給藥后，小鼠心律失常的發(fā)生率為100%。黎雖宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃草烏生品能使大鼠出現(xiàn)室性早搏等心律失常現(xiàn)象;而黃草烏經(jīng)炮制后，生物堿含量減少，且對(duì)大鼠心電圖的各項(xiàng)指標(biāo)也無明顯影響，提示黃草烏炮制前后誘導(dǎo)大鼠心律失常的毒性差異可能與滇烏堿含量變化有關(guān)。然而，關(guān)于滇烏堿誘導(dǎo)心律失常的毒性機(jī)制仍未明確。

心律失常是最常見的心血管疾病，是主要由于心臟沖動(dòng)起源部位、興奮秩序以及傳導(dǎo)速度異常而引起的心臟搏動(dòng)頻率與節(jié)律障礙。心律失常不僅會(huì)加重原有心臟疾病的進(jìn)展（如加速心力衰竭），而且也是導(dǎo)致患者發(fā)生猝死的重要原因之一[8]。Ca2+不僅是維持心臟電活動(dòng)的關(guān)鍵因素，也是引發(fā)心肌收縮的直接激活劑，因此任何引起Ca2+含量波動(dòng)的因素都會(huì)影響心肌興奮-收縮偶聯(lián)（ECC）過程，最終導(dǎo)致心律失常[9]?；诖?，本研究擬從整體動(dòng)物水平觀察滇烏堿對(duì)大鼠心電圖的影響，并探究其對(duì)腺苷三磷酸（ATP）含量及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性、心肌細(xì)胞中Ca2+含量、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步揭示滇烏堿誘導(dǎo)心律失常的毒性機(jī)制，為黃草烏的臨床安全使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BL-420F型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），Infinite 200 PRO型多功能熒光酶標(biāo)儀（奧地利Tecan Austria GmbH公司），HZT-A1000型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司），3100型CO2培養(yǎng)箱（廣州市源起生物科技有限公司），Mini型蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），LG2000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

滇烏堿對(duì)照品（批號(hào)MUST17102101，純度≥98%）、烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)MUST17110910，純度≥98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;ATP含量測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200712）、ATP酶活性測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200628）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200723）均購自南京建成生物工程研究所;Fluo-3/AM Ca2+熒光探針（批號(hào)75400150）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;兔源雷諾定受體2（RyR2）單克隆抗體（批號(hào)GR3200692-1）購自美國Proteintech公司;兔源Ca2+-ATP酶（SERCA2）單克隆抗體（批號(hào)GR3182873-9）、兔源3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號(hào)GR3250452-7）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）抗體（批號(hào)GR3321256-8）購自美國Bioworld公司;超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物（批號(hào)B347825E）購自美國Boster公司;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，共32只，雌雄各半，體質(zhì)量為240～260 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002、質(zhì)量合格證號(hào)為44007200078479。大鼠購入后飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房中[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2017-0125]。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h照明/12 h黑暗循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案已獲得廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 分組與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，滇烏堿低、高劑量組（0.09、0.14 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對(duì)照，0.88 mg/kg），每組8只。各給藥組大鼠的給藥劑量是參考文獻(xiàn)[10-11]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，其中滇烏堿低、高劑量分別為大鼠的1/6、1/4半數(shù)致死量（LD50），烏頭堿的劑量為大鼠的1/10 LD50。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（均以生理鹽水為溶劑溶解），正常對(duì)照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水;灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 心電圖觀察

末次灌胃1 h后，腹腔注射3%水合氯醛（10 mL/kg）將大鼠麻醉，然后將大鼠按仰臥位固定，并將正向電極插入其右上肢，負(fù)向電極插入其左下肢，底線插入其右下肢，然后使用生物信號(hào)采集系統(tǒng)采集大鼠60 min內(nèi)的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，記錄并分析其心率、QRS波、PR間期以及校正后QT間期（QTc間期）的變化。其中，QTc間期是根據(jù)公式QTc=QT/RR1/2計(jì)算得到（RR為標(biāo)準(zhǔn)化的心率值，根據(jù)60除以心率得到）[6]。

2.3 標(biāo)本采集與處理

記錄大鼠的心電圖后，將大鼠處死，打開其胸腔，在無菌條件下迅速剝離其心臟。心臟用生理鹽水沖洗，并用濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 心肌組織中ATP含量測(cè)定

稱取心肌組織樣本0.1 g，以水制成100 g/L的勻漿液后，置于沸水浴中煮10 min;取出，渦旋混勻1 min，然后以3 500 r/min離心10 min，取上清液。根據(jù)ATP含量測(cè)定試劑盒說明書方法操作，通過酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠心肌組織中ATP的含量。

2.5 心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定

稱取心肌組織樣本0.1 g，以水制成100 g/L的勻漿液，按照ATP酶活性測(cè)定試劑盒說明書方法操作，測(cè)定大鼠心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性。采用BCA法測(cè)定各組大鼠心肌組織勻漿液的蛋白濃度，ATP酶的活力單位以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生無機(jī)磷的量（μmol Pi/mg prot/h）表示。

2.6 心肌細(xì)胞中Ca2+含量測(cè)定

稱取心肌組織樣本約50 mg，加入水充分研磨，于300目尼龍網(wǎng)上過濾得到細(xì)胞懸液;以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞2遍，隨后加入含有5 μmol/L Fluo-3/AM Ca2+熒光探針的無血清DMEM培養(yǎng)基5 mL，再加入1 μL 25%Pluronic F127，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;取出，以? ? ?1 000 r/min離心5 min，以PBS洗滌3次，洗脫未負(fù)載的Fluo-3/AM Ca2+熒光探針;然后使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+的熒光強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度越高代表Ca2+的含量越高）。

2.7 心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)測(cè)定

每組隨機(jī)選取3只大鼠的心肌組織樣本，采用Western blot法進(jìn)行測(cè)定。稱取心肌組織樣本約100 mg，加入裂解液提取總蛋白;以BCA法進(jìn)行蛋白定量分析，然后將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離（分離膠電壓為100～200 V，濃縮膠電壓為60～100 V，電泳時(shí)間為60 min），隨后濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（轉(zhuǎn)膜電流均為300 mA，RyR2蛋白的轉(zhuǎn)膜時(shí)間為130 min，SERCA2蛋白的轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min）;以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入RyR2一抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000）、SERCA2一抗（稀釋比例為1 ∶ 3 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶ 10 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 40 000），于室溫孵育1 h;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入ECL顯色，于化學(xué)發(fā)光成像儀中成像。采用Image J v1.8.0軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以各目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 滇烏堿對(duì)大鼠心電圖的影響

正常對(duì)照組大鼠保持竇性心律。與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠QRS波時(shí)限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），以產(chǎn)生室性期前收縮的心電圖變化為主;滇烏堿高劑量組大鼠心率顯著增快（P<0.05），QRS波時(shí)限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），主要表現(xiàn)為雙向性室性心動(dòng)過速;烏頭堿組大鼠的心率顯著增快（P<0.01），QRS波時(shí)限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），主要表現(xiàn)為單形性室性心動(dòng)過速等心電異常。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心電圖各參數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠的心電圖見圖1，心電圖各參數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 滇烏堿對(duì)大鼠心肌組織中ATP含量的影響

與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中ATP含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌組織中ATP含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中ATP含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 滇烏堿對(duì)大鼠心肌組織中ATP酶活性的影響

與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌組織中上述ATP酶活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中ATP酶活性測(cè)定結(jié)果見表2。

3.4 滇烏堿對(duì)大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+含量的影響

與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠心肌細(xì)胞中Ca2+含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.5 滇烏堿對(duì)大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中SERCA2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），但RyR2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中SERCA2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），RyR2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;滇烏堿高劑量組大鼠心肌組織中RyR2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），SERCA2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。各組大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表3。

4 討論

心電圖記錄了心臟興奮的產(chǎn)生、傳導(dǎo)、恢復(fù)過程中的生物電變化，在臨床中反映了患者的心臟功能，是監(jiān)測(cè)、診斷心血管疾病的重要指標(biāo)之一[12]。QRS波是心室除極波，QRS波群時(shí)限延長可能與室性異位激動(dòng)產(chǎn)生的心室除極有關(guān)[13]。PR間期代表由竇房結(jié)產(chǎn)生的興奮經(jīng)由心房、房室交界和房室束到達(dá)心室并引起心室開始興奮所需要的時(shí)間，若PR間期異常，則提示興奮傳導(dǎo)異常;QTc間期延長可導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生，在診斷某些心律失常和判斷心肌梗死患者預(yù)后等方面有著重要的臨床意義[14]。由于烏頭堿是烏頭屬植物最主要的心臟毒性物質(zhì)，能引起多種心律失常，故可作為烏頭屬植物毒性成分的典型代表[15]。因此，本研究以烏頭堿為陽性對(duì)照藥物來考察滇烏堿致大鼠心律失常的毒性作用。心電圖觀察結(jié)果顯示，給予不同劑量的滇烏堿后，大鼠的心率不同程度地加快，QRS波時(shí)限和QTc間期不同程度地延長，并且出現(xiàn)了室性早搏、室性心動(dòng)過速等心律失?，F(xiàn)象。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為第二信使，可以介導(dǎo)以膜電位變化為特征的興奮過程和以肌絲滑行為基礎(chǔ)的收縮過程，即ECC過程;若細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常，可導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)速度減慢、心室收縮功能減弱，從而影響心臟功能的正常發(fā)揮[16]。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵，是廣泛存在于心肌及其他組織細(xì)胞膜上的一種糖蛋白，也是一種能催化ATP水解的酶，這種泵每消耗1分子 ATP所釋放的能量就可逆濃度將3個(gè)Na+泵出細(xì)胞外，同時(shí)將2個(gè)K+泵入細(xì)胞內(nèi);一旦Na+-K+-ATP酶活性降低，就會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)Na+濃度過高，間接促進(jìn)Na+-Ca2+交換，從而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致心肌的興奮-收縮功能紊亂[17]。Ca2+-Mg2+-ATP酶又稱鈣泵，能夠利用水解ATP釋放的能量驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+泵出細(xì)胞，以維持細(xì)胞內(nèi)低濃度的游離Ca2+;當(dāng)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受到抑制時(shí)，容易導(dǎo)致心肌游離Ca2+濃度過高，而Ca2+超載程度與心肌損傷程度呈正相關(guān)[18]。心肌細(xì)胞中過多的Ca2+以磷酸鹽的形式沉積，引起線粒體氧化磷酸化的電子傳遞功能障礙，造成ATP合成受阻，導(dǎo)致能量無法轉(zhuǎn)化成ATP為心肌所用，進(jìn)一步抑制ATP酶活力，形成“ATP合成障礙-Ca2+超載”的惡性循環(huán)，從而誘導(dǎo)心律失常發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量滇烏堿后，大鼠心肌組織中ATP含量不同程度地減少，心肌細(xì)胞中Ca2+含量不同程度地增加，心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性不同程度地降低。這提示Ca2+超載可能是滇烏堿致大鼠心律失常的毒性機(jī)制之一。

在ECC過程中，相關(guān)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控紊亂會(huì)導(dǎo)致胞漿Ca2+負(fù)載和肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放失調(diào)，這也是引起Ca2+依賴型心律失常的關(guān)鍵因素[20]。RyRs又稱蘭尼堿受體，是位于肌漿網(wǎng)中的一種選擇性陽離子通道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，RyRs有3種亞型，其中RyR2是主要的Ca2+釋放通道，主要分布于心肌，對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的濃度影響尤為顯著：正常情況下，當(dāng)興奮沖動(dòng)傳導(dǎo)至心肌細(xì)胞時(shí)，L型Ca2+通道開放，然后細(xì)胞外少量的Ca2+內(nèi)流，而短時(shí)間內(nèi)迅速升高的游離Ca2+濃度會(huì)增加RyR2對(duì)Ca2+的敏感性，使RyR2被激活并同步釋放大量Ca2+，引起心肌收縮[21]。但游離Ca2+在胞漿內(nèi)對(duì)RyR通道具有雙向調(diào)節(jié)作用：當(dāng)Ca2+處于低濃度（0.01～1 mmol/L）時(shí)，可以刺激并激活RyR2通道;當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)，RyR2通道的開放程度達(dá)到最大;此時(shí)若Ca2+濃度繼續(xù)升高（>1 mmol/L），心肌組織為避免過長或過強(qiáng)的收縮，則會(huì)抑制RyR2通道開放[22]。在ECC過程中，待心肌細(xì)胞處于舒張期后，廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞肌漿網(wǎng)中的SERCA2則可以利用ATP供能，驅(qū)動(dòng)胞漿內(nèi)Ca2+重新泵入鈣庫中，從而降低胞漿中Ca2+濃度，以維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)為心肌細(xì)胞的下一次收縮儲(chǔ)存足夠的Ca2+量[23]。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量滇烏堿后，大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達(dá)均不同程度地下調(diào)，表明滇烏堿可造成肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的再攝取功能障礙，從而導(dǎo)致Ca2+超載，使心肌細(xì)胞喪失自律性、興奮性、傳導(dǎo)性等生理功能，最終引起病理狀態(tài)下心肌收縮、舒張功能的障礙。

綜上所述，滇烏堿可導(dǎo)致大鼠心律失常;其毒理學(xué)機(jī)制可能與降低心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下調(diào)心肌組織中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)yR2、SERCA2的表達(dá)，從而導(dǎo)致Ca2+超載有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-20 修回日期：2021-10-20）

（編輯：林 靜）